갈색세포종 및 부신경결종(pheochromocytoma and paraganglioma, PPGLs)은 카테콜아민을 분비하는 신경내분비 종양으로서, 비특이적인 임상증상으로 인해 카테콜아민의 과다 분비를 시사하는 생화학적 지표의 측정이 진단에 필수적이다. 메타네프린(metanephrine, MN)과 노르메타네프린(normetanephrine, NMN)은 에피네프린과 노르에피네프린의 대사물질로, 카테콜아민보다 교감신경 활성에 영향을 덜 받고, 종양세포에 존재하는 카테콜-O-메틸기전달효소(catechol-O-methyltransferase, COMT)에 의해 지속적으로 분비되기 때문에 PPGLs를 진단하거나 배제하는 데 더욱 유용하다[1]. 이에 미국내분비학회 지침에서는 PPGLs가 의심되는 경우 우선적으로 혈장 또는 소변 MN과 NMN을 액체크로마토그래피-탠덤질량분석기(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)법으로 측정할 것을 권고하고 있다[2]. 그러나 카테콜아민 및 그 대사산물들은 방향족 고리를 가지는 모노아민계 신경전달물질이므로 빛에 민감하고 산화되기 쉬운 화학적 특성을 지닌다[3]. 그럼에도 불구하고 MN과 NMN의 안정성을 보장하는 검체의 보관 및 취급조건에 대해 합의된 표준지침이 없어[4], 내/외부정도관리와 원거리 위탁검사에 있어 검체 불안정성으로 인한 검사 전 오류, 더 나아가 PPGLs 진단의 신뢰도 저하를 초래할 가능성이 있다. 이러한 이유로 MN과 NMN의 안정성에 관한 연구들이 시도되어 왔으나 검체의 종류, 검사법 및 취급조건에 대한 평가가 부분적 및 산발적으로 시행되어 안정성 조건을 체계적으로 확립하는 데에 어려움이 있었다. 이에 저자들은 기존 연구들을 검토하고 이를 토대로 표준검사법인 LC-MS/MS를 이용한 종합적인 MN 및 NMN 안정성을 평가하고자 본 연구를 수행하였다. 본 연구는 삼성서울병원 연구윤리위원회로부터 심의(IRB 승인번호: 2019-01-127)를 득한 후 진행되었으며, 동의서는 면제되었다.

LC-MS/MS를 이용한 MN 및 NMN 분석에 이용된 내부표준물질은 MN-d3과 NMN-d3 (CDN Isotopes Inc., Pointe-Claire, Canada)을 메탄올에 용해시켜 MN과 NMN의 최종 농도가 각각 20 ng/mL와 40 ng/mL가 되도록 제조하였다. 보정물질은 혈장과 소변에 대해 각각 6PLUS1 Multilevel Plasma Calibrator Set (Chromsystems, Gräfelfing, Germany)와 HPLC Urine Calibrator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하였으며, 모두 –70°C에 보관되었다. 혈장 검체는 각 400 µL를 분주하여 Strata CW-X 카트리지(Phenomenex, Torrance, CA, USA)를 이용해 고체상 추출법으로 추출하였다. 소변 검체는 1 mL당 50 µL의 3 N-HCl을 첨가하여 가수분해시킨 이후 90℃에서 25분 동안 가온한 다음 100 µL를 취하여 고체상 추출법으로 추출하였다. 추출된 혈장 3 µL 또는 소변 1 µL를 LC-MS/MS (Agilent 1260 Infinity HPLC system; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 장비에 주입하여, 양이온 전자분무이온화 방식을 사용하여 다중반응모니터링(multiple reaction monitoring) 분석하였다(MN, m/z 180.1 → 165.1; MN-d3, m/z 183.1 → 168.1; NMN, m/z 166.1 → 134.1; NMN-d3, m/z 169 → 137.1) [5,6]. 분석 가능 농도범위는 각각 혈장 MN 0.04–100 nmol/L, NMN 0.08–200 nmol/L, 소변 MN 10–30,000 µg/L, NMN 10–30,000 µg/L였다. 내부정도관리는 혈장 및 소변 검체 각각 3가지 및 2가지 농도의 정도관리물질(MassCheck, Chromsystems; Lyphochek, Bio-Rad)로 검사를 시행하는 날마다 시행하였고, 배치 간 정밀도 변이계수 <15%로 유지되었다. 본 분석법은 국내•외 지침에 따라 평가 및 검증되었으며[7], 보다 상세한 내용은 저자들의 이전 보고에 기술되어 있다[5,6].

안정성 평가대상 검체 제조를 위해 2019년 3월부터 2019년 5월까지 삼성서울병원에서 건강검진을 위해 수집된 혈장 및 소변 잔여 검체가 사용되었다. 혈장은 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 튜브에 채혈된 전혈 검체를 원심분리(4℃, 4,000 rpm, 10분)하여 준비하였다. 소변은 보존제 처리를 하지 않은 임의뇨 검체를 사용하였다. 혈장과 소변에 MN과 NMN (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 고농도 혈장 검체(MN, 4 nmol/L; NMN, 11 nmol/L), 저농도 혈장 검체(MN, 0.15 nmol/L; NMN, 0.7 nmol/L), 고농도 소변 검체(MN, 1,550 µg/L; NMN, 3,500 µg/L), 저농도 소변 검체(MN, 130 µg/L; NMN, 250 µg/L) 이렇게 4종류의 검체를 제조하였다. 초기 농도를 측정한 후 보관온도에 따른 단기 및 장기 안정성, 냉/해동 안정성 그리고 이송 안정성을 확인하고자 모두 46개의 분주를 나누었다. 실온(25℃)에서는 24시간 동안 보관하며 6시간마다 농도를 측정하였고, 4℃, –20℃에서 보관한 검체들은 8일 동안 보관하며 2일마다 농도를 측정하였다. –80℃에서 보관한 검체는 7개월까지 보관하며 농도를 측정하였다. 냉/해동 안정성 평가를 위해 –20℃에서 24시간 보관 후 실온에서 10분 해동하고 농도를 측정하였으며, 이 과정을 3회 반복하여 초기 농도와 비교하였다. 또한 실제 검체의 이송 상황을 가정한 이송 안정성을 평가하고자 드라이아이스와 함께 일주일간 보관하며 실온에서 해동하여 농도를 측정하였다. 모든 검체들은 각각 2회씩 측정되었으며, 이들의 평균값을 산출하여 분석에 사용하였다. 편차(%bias)는 해당 시점의 농도에서 초기 농도를 뺀 값을 초기 농도로 나눈 값의 백분율로 정의하였고, 안정성에 대한 기준은 편차 <±15%로 설정하였다[8].

혈장 MN 및 NMN에 대한 온도 및 시간에 따른 농도 변화를 Fig. 1에 정리하였다. 실온에서 24시간 동안 MN은 –3.2%–9.7%, NMN은 –3.0%–7.4%의 편차를 보였다(Fig. 1A). 4℃에서 MN과 NMN은 각각 –0.1%–13.4%와 –7.0%–7.9%의 편차를 보였으며, –20℃에서 MN과 NMN은 각각 –7.0%–13.7%와 –2.0%–10.1%의 편차를 보였다(Fig. 1B, C). –80℃에서 7개월간 보관한 후 측정한 농도에서 MN과 NMN은 각각 –4.7%–9.9%와 –10.9%–7.1%의 편차를 보였다(Fig. 1D). 고농도 NMN의 2개월 및 3개월째 측정값이 다른 검체들에 비해 비교적 크게 증가 및 감소되어 보이지만, 실제 편차는 각각 7.1% 및 –10.9%로 허용범위 이내였다. 소변 MN 및 NMN의 보관온도에 따른 농도 변화는 Fig. 2에 정리하였다. 실온에서 24시간 동안 측정된 농도 변화는 MN에서 –8.1%–9.0%, NMN은 –5.4%–6.4%의 편차를 보였다(Fig. 2A). 4℃에서 8일간 보관하며 측정한 MN과 NMN은 측정오차로 보이는 하나의 검체를 제외하면 각각 –5.3%–2.7%와 –3.1%–0.9%의 편차를 보였다(Fig. 2B). –20℃에서 MN과 NMN은 각각 –5.0%–5.8%와 –4.8%–8.3%의 편차를 보였다(Fig. 2C). –80℃에서 7개월간 보관하며 농도 변화를 확인한 결과도 MN 및 NMN이 각각 –4.3%–2.9% 및 –3.2%–8.5%로 유의한 농도 변화가 관찰되지 않았다(Fig. 2D).

Figure 1. The concentrations of plasma-free metanephrine (open) and normetanephrine (closed) at room temperature (A), 4℃ (B), –20℃ (C), and –80℃ (D).

Figure 2. The concentrations of urine total metanephrine (open) and normetanephrine (closed) at room temperature (A), 4℃ (B), –20℃ (C), and –80℃ (D).

냉/해동과정을 3회 반복한 후 측정한 혈장 MN은 고농도에서 1.3%, 저농도에서는 13.6%의 편차를 보였으며, NMN은 고농도에서 –5.6%, 저농도에서는 –1.8%로 유의한 변화가 없었다(Fig. 3A). 소변 MN도 냉/해동 3회 후까지 안정적이었는데, 고농도에서 4.1%, 저농도에서 –3.8%의 편차를 보였으며, NMN은 고농도에서 1.0%, 저농도에서 0.7%의 편차를 보였다(Fig. 3B). 드라이아이스에서 일주일간 보관한 후, 혈장 MN은 고농도와 저농도에서 각각 2.5%와 9.8%, NMN은 고농도와 저농도에서 각각 –5.4%와 11.0%, 소변 MN과 NMN은 –0.4%에서 –4.5%의 편차로 유의한 변화를 보이지 않았다.

Figure 3. The freeze and thaw stability of plasma-free metanephrine (open square) and normetanephrine (closed square) (A), and urine total metanephrine (open circle) and normetanephrine (closed circle) (B).

미국과 유럽의 대규모 연구들에 따르면[8,9], 혈장 MN 및 NMN 검사는 민감도 96%–99%, 특이도 85%–89%이며, 소변 MN 및 NMN 검사의 민감도는 다소 낮은 90%이나 98%의 높은 특이도를 보여, 대부분의 경우 혈장 및 소변검사가 상호 보완적인 검사로 함께 시행되고 있다. 따라서 혈장과 소변 검체 모두 검사 전 오차를 최소화하여 위양성 및 위음성 결과를 줄이는 것이 PPGLs의 배제 및 진단에 중요하다. 특히 혈장 검체에서 위양성을 야기하는 요인들에는 환자의 약물 복용력, 식이상태, 채혈 시 자세 등을 비롯해 검체의 보관조건이 지적되고 있다[10]. 이에 혈장 및 소변의 MN과 NMN 보관조건에 따른 안정성 연구들이 지속적으로 진행되어 왔고 이를 Table 1에 요약하였다[3,4,11-17].

Table 1 . A summary of previous studies on the stability of metanephrine and normetanephrine in plasma or urine.

Reference	Specimen	Levels	Method	Conditions		Results
				Temperature (℃)	Duration
Willemsen et al. [11] (2003)	Whole blood plasma	1	HPLC	RT (for whole blood)	6 hours	In whole blood, unstable at RT; in whole blood, stable within 6 hours at 4℃
				RT (for plasma)	3 days	In plasma, unstable at RT
				4, –20 (for plasma)	1 month	In plasma, stable within 3 days at 4℃; in plasma, stable within 1 month at –20℃
de Jong et al. [12] (2007)	Plasma	3	LC-MS/MS	RT	24 hours	In plasma, stable within 24 hours at RT
				10, 4	7 days	In plasma, stable within 7 days at 10℃ and 4℃
				Freeze (–20)/thaw (RT)	3 cycles	In plasma, stable in 3 freeze-thaw cycles
Ross et al. [13] (2011)	Plasma	1	HPLC	–20, –80	60 months	In plasma, stable within 12 months at –20℃ and –80℃
Danese et al. [4] (2020)	Whole blood plasma	1	LC-MS/MS	RT, 4 (for whole blood)	3 hours	In whole blood, unstable at RT; in whole blood, stable within 3 hours at 4℃
				RT, 4 (for plasma)	6 hours	In plasma, stable within 6 hours at RT and 4℃
Wang et al. [3] (2021)	Whole blood plasma	2	LC-MS/MS	RT, 4 (for whole blood)	4 hours	In whole blood, unstable at RT; in whole blood, stable within 4 hours at 4℃
				RT, 4 (for plasma)	6 hours	In plasma, stable within 6 hours at RT and 4℃
				–20, –80	7 days	In whole blood & plasma, stable within 7 days at –20℃ and –80℃
Chan et al. [14] (2000)	Urine with/without preservatives	1	HPLC	10, 30	8 days	In urine without/with preservatives, unstable at 10℃ and 30℃
				–80	1 month	In urine without/with preservatives, stable within 22 days at –80℃
Willemsen et al. [15] (2007)	Urine with/without preservatives	1	HPLC	RT	7 days	In urine without/with preservatives, stable within 7 days at RT
Peitzsch et al. [16] (2013)	Urine with/without preservatives	1	LC-MS/MS	RT	3 days	In urine without/with acidification, stable within 3 days at RT
	Urine with strong acidification			RT	3 days	In urine with strong acidification, unstable (especially, normetanephrine)
Wang et al. [17] (2020)	Urine without preservatives	1	LC-MS/MS	RT, 4	4 days	In urine without preservatives, stable within 4 days at RT and 4℃
				–20	7 months	In urine without preservatives, stable within 7 months at –20℃
This study (2022)	Plasma urine without preservatives	2	LC-MS/MS	RT	24 hours	In plasma/urine, stable within 24 hours at RT
				4, –20	8 days	In plasma/urine, stable within 8 days at 4℃ and –20℃
				–80	7 months	In plasma/urine, stable within 7 months at –80℃
				Freeze (–20)/thaw (RT)	3 cycles	In plasma/urine, stable in 3 freeze-thaw cycles
				With dry-ice	7 days	In plasma/urine, stable within 7 days with dry-ice

Abbreviations: HPLC, high performance liquid chromatography; RT, room temperature; LC-MS/MS, liquid chromatography-tandem mass spectrometry..

기존의 연구들에서 공통적으로 혈장이 전혈보다 안정하다는 것이 확인된 바 있다[3,4,11]. 전혈은 실온보관 시 MN은 2시간 만에 유의하게 감소, 반대로 NMN은 15분 이후부터 급격히 증가하여 1시간 만에 유의한 농도의 증가를 보였다고 하였다[11]. 그러나 냉장온도인 4℃에서는 MN과 NMN 모두 적어도 6시간까지는 전혈상태에서 안정함을 보고하였다. 반면, 다른 보고에서는 전혈 MN도 실온에서 농도가 증가하는 경향성을 보였다[4]. 이렇게 실온에서 MN과 NMN의 농도가 증가하는 현상은 적혈구에 존재하는 COMT 효소의 ex-vivo 활성으로 인한 카테콜아민 대사의 결과이며, 4℃에서는 COMT 효소 활성이 억제되어 실온에서 보이는 농도 증가현상이 확인되지 않는다고 하였다[4]. 이에 채혈 즉시 원심분리하여 혈장상태로 보관하는 것이 바람직하며 불가능한 상황일 때에는 냉장보관이 권고된다[4,11].

혈장상태로 보관하는 경우, 보관온도에 따른 단기 안정성 및 장기 안정성에 대한 연구들이 진행되었다[3,4,11-13]. 실온에서 NMN은 24시간까지 안정적이고 48시간 이후 측정한 농도부터 유의한 감소를 보인 반면, MN은 보관 4시간 만에 급격한 농도 감소를 보여 24시간 이후에는 초기 농도의 절반까지 감소하였다는 보고가 있었다[11]. 그러나 이와는 달리 MN 및 NMN 모두 혈장상태로 실온에서 24시간 동안 유의한 농도 변화가 없었다는 보고도 있다[12]. 이에 본 연구에서 실온보관 안정성을 재평가한 결과, 혈장은 MN과 NMN 모두 실온에서 최소 24시간 안정적임을 확인하였다. 4℃에서 혈장을 보관할 경우, 최대 일주일까지 평가한 연구결과에 따르면, 보관기간 내내 안정적인 농도를 보였다[12]. 본 연구에서도 8일간 유의한 농도의 변화가 없었으므로, 혈장은 냉장상태에서 8일까지 안정적으로 보관할 수 있음을 확인할 수 있었다. 장기 안정성에 대한 평가는 Ross 등[13]의 연구가 유일한데, –20℃ 및 –80℃에서 60개월간 보관하며 농도 변화를 관찰하여 1년까지는 안정적임을 확인하였다. 본 연구에서도 –80℃에서 7개월까지 안정적임을 다시 한 번 확인하였다. 한편, Ross 등[13]에 따르면, 1년 이후에 발생한 MN과 NMN의 유의한 농도 변화도 검체 자체의 안정성보다 장기간 검사의 배치 간 안정성의 영향일 가능성이 크다고 하였으므로, 연구 등의 목적으로 1년 이상의 검체 장기 보관이 필요한 상황에서는 대해서는 추가 평가가 필요할 수 있겠다.

보관온도와 기간 외에도 채혈용기의 항응고제 종류 및 원심분리의 온도가 혈장 MN과 NMN 안정성에 영향을 미치는 또다른 요인이 될 수 있다[3]. 일반적으로 혈장 MN 및 NMN 검사에서 EDTA-용기에 채혈할 것을 권고하고 있으나[18], 전혈을 보관하는 경우에 한하여 헤파린-용기가 EDTA-용기보다 저농도의 MN에 한해 안정성에 도움이 되었다는 보고도 있다[3]. 원심분리의 온도는 NMN의 안정성에만 영향을 미쳤는데, 4℃에서 원심분리한 검체에 비해 실온에서 원심분리한 검체가 유의하게 낮은 농도를 보였다고 보고하였다[3].

소변 카테콜아민은 보존제(HCl, Na₂EDTA, Na₂S₂O₅ 등)를 첨가하였을 때 자발적 산화반응이 억제되어 안정성이 더 오래 지속된다고 알려져 있다[19]. 반면, MN과 NMN은 보존제의 여부에 따라 보관 안정성이 달라지지 않았다고 보고된 바 있다[14,15]. 수용액 내에 존재하는 유리 MN과 NMN의 농도는 시간이 지남에 따라 감소한다. 그러나 소변 내에서는 결합 MN과 NMN이 비결합 MN과 NMN으로 해리되는 현상이 함께 일어나 안정성에 영향을 미친다[15]. Peitzsch 등[16]은 소변에 일반적인 농도보다 더 높은 농도의 HCl을 첨가하여 PH 1 수준으로 과도하게 산성화시키면, 시간이 지날수록 유리 MN과 NMN이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 이는 소변이 산성화될수록 결합 MN과 NMN의 해리가 더 촉진됨을 의미한다. 따라서 보존제를 적절하게 사용하지 않으면 MN 과 NMN의 검체 안정성에 오히려 부정적인 영향을 미친다는 것을 염두에 두어야 한다.

미국 College of American Pathologists는 소변 MN 및 NMN 검사에 대한 외부정도관리용 검체 보관 시, 소변 검체를 산성화시킨 후, 2–8℃에서 최대 5일간 보관을 권고하고 있지만[20], 기존의 연구들과 본 연구의 결과들을 종합하였을 때[14,15,17], 소변은 산성화 과정을 생략하여도 실온에서 8일간 안정성을 보장할 수 있으며, 4℃에서도 8일간의 안정성이 확인되었다. 또한 본 연구에서는 보존제가 없는 소변 검체라도 –80℃ 보관 시 최소 7개월까지 안정적임을 확인하였고, 드라이아이스로 원거리 이송되는 상황에서도 적어도 일주일 간 안정성을 보장할 수 있음을 처음으로 확인하였다.

결론적으로, MN 및 NMN의 농도를 측정하고자 할 때, 혈장 및 소변 검체 모두 실온에서는 최소 24시간 보관할 수 있으며, 4℃ 및 –20℃에서는 8일간 보관이 가능하다. 그 이상의 장기 보관이 필요한 경우, –80℃ 보관이 권장되는데, 본 연구에서는 7개월까지의 안정성을 확인하였다. 장기간 보관을 위해 검체를 냉동하였다가 다시 해동해야 할 경우, 3회의 냉/해동 주기까지 안정함을 확인하였고, 검체의 원거리 이송이 필요한 경우 드라이아이스와 함께 일주일 이내로 운반하면 검사에 유의한 영향이 없는 것으로 확인하였다. 다만, 본 연구에서는 선행연구 결과 및 현실적인 보관기간을 고려하여 연구기간이 설정된 바, 각 조건에서 안정성을 유지할 수 있는 최대 기간을 확인하지 못한 한계점이 있다. 이에 후속연구를 통해 각 조건에서 안정성을 잃기 시작하는 최대 보관 가능 기간을 평가하는 것이 필요하겠다. 그러나 본 평가의 결과를 통해 검체의 안정성을 보장할 수 있는 보관 및 운반조건이 확립된다면 검사의 신뢰성 향상 및 PPGLs의 정확한 진단에도 기여할 것으로 판단된다.

이 연구는 대한임상검사정도관리협회의 2019년도 학술연구과제 연구비(과제번호: 2019-09) 지원으로 수행되었다.