Cycle threshold (Ct) 값은 검체에서 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)의 반정량적 추정치로 생각되며 임상적으로 환자에서 감염성을 예측하는 지표로 사용된다[1,2]. 그러나 많은 전문가들은 정성검사인 SARS-CoV-2 polymerase chain reaction (PCR) 검사에서 Ct값을 임상에서 직접적으로 사용하는 것을 권장하지 않는다[3,4]. 실제로 한국, 오스트리아와 미국의 신빙도조사사업 결과 검사실 간의 Ct값 편차가 유의미하게 보였다[5-8]. 그러나 신빙도조사사업에서 검사실 내 Ct값 편차가 1.66 이상인 경우는 적어, 대부분의 국내 검사실에서 같은 검체에서 검사실 내 재현성은 신뢰할 만하였다[8].

이 연구를 통해 2022년에 시행된 신빙도조사사업 결과를 분석하여 국내 검사실 내 Ct값 편차를 확인하고자 하였다. 이 연구는 SARS-CoV-2 유병률이 급격히 상승하였던[9] 2022년 SARS-CoV-2 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time reverse transcription polymerase chain reaction, rRT-PCR)에 대한 전국적 신빙도조사사업 결과를 분석하여 Ct값의 검사실 내 및 검사실 간 변동을 조사하였다.

1. 숙련도조사

국내에서 SARS-CoV-2 rRT-PCR 검사를 수행하는 검사실은 대한진단검사정도관리협회(‘대한임상검사정도관리협회’에서 변경) (Korean Association of External Quality Assessment Service)가 실시하는 신빙도조사사업에 의무적으로 참여해야 한다. 검체 준비, 검증 및 이송, 데이터 보고는 이전 연구에서 기술된 바와 같다[8,10]. 간단하게 기술하면 KRISS SARS-CoV-2 Proficiency Panel (Korea Research Institute of Standards and Science, Daejeon, Korea)을 이용해 검체를 제조하였는데, 신빙도조사사업 물질은 하나의 높은 농도 양성 검체, 동일한 두 개의 중간 농도 양성 검체, 동일한 두 개의 낮은 농도 양성 검체로 총 5개의 양성 검체와 두 개의 음성 검체 등 네 가지 유형의 7개 검체로 구성되었다. 3단계 농도의 양성 검체는 lentivirus 벡터에 삽입된 전체 SARS-CoV-2 유전체를 사용하여 제조하였으며, 음성 기준물질에는 인간 RNase P 유전자를 포함하였다. 이 검체들은 2022년 3월(1차)과 10월(2차)에 참여 검사실로 송부하였고, 4일 이내에 회신을 요청하였다.

2. 자료 분석

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 권고에 따라 정성 평가의 결과 분석은 예상 결과와 80% 이상 일치하는 반응을 보인 검체에 대해서 분석하였다. 검사실 내 변이는 동일한 검사실에서 PCR 시약을 사용하여 테스트한 중간 농도 양성 샘플과 낮은 농도 양성 샘플에 대한 envelope (E) 유전자의 Ct값의 차이로 계산하였고, 위음성인 경우에는 이 분석에서 제외하였다. 검사실 내 변이의 허용치는 이전 연구와 같이 0.5 log 농도 차이를 반영하는 Ct값 1.66으로 설정하였다. 대한진단검사정도관리협회에서 바이러스 분자검사 1 신빙도조사사업에 참여하고 있는 기관과 바이러스 분자검사 1 신빙도조사사업에 참여하고 있지 않은 기관의 결과를 분석할 때는 카이제곱 검정을 이용하여 비교하였다. 동일한 추출시약 및 PCR 시약을 사용한 경우의 E 유전자의 Ct값은 상자 수염 그림(box-and-whisker plot)을 사용하여 실험실 간 변이를 비교 분석하였다. 동일한 PCR 시약을 사용한 경우 E 유전자의 Ct값은 Student t 검정하여 비교하였다. 기술통계 분석에는 MedCalc ver. 20.015 (MedCalc Software Ltd., Ostend, Belgium)와 Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)을 사용하였다.

2022년 국내 SARS-CoV-2 항목 신빙도조사에는 1차에 278기관 그리고 2차에 301기관이 참가하였다. 국내에서 사용되는 추출시약은 1차에서 65기관(23.4%)이 기타로 답변한 것을 제외할 때 19종의 시약이 사용되고 있었고, Real-Prep Viral DNA/RNA kit (Bioneer, Daejeon, Korea)이 33기관(11.9%), Genolution Viral NA kit (Genolution, Seoul, Korea)이 32기관(11.5%) 순으로 많았다. 2차에서도 기타 80기관(26.6%)을 제외할 때 18종이 사용되었고, Genolution Viral NA kit이 37기관(12.3%), Real-Prep Viral DNA/RNA kit이 27기관(9.0%) 순이었다. PCR 시약의 경우에는 1차에서 총 16종이 사용되었으며, STANDARD M nCoV Real-Time Detection kit (SDBiosensors, Suwon, Korea)를 사용하는 기관이 94개(33.8%)로 가장 많았으며, 다음은 Allplex SARS-CoV-2 Assay (Seegene, Seoul, Korea)으로 56기관(20.1%)이 사용하였다. 2차에서도 STANDARD M nCoV Real-Time Detection kit를 사용하는 기관이 96개(31.9%)로 가장 많았고, 다음은 Allplex SARS-CoV-2 Assay으로 53기관(17.6%)이 사용하었다. 2차에서는 사용되는 PCR 시약의 종류가 총 19종으로 증가하였다.

1차 숙련도조사에서는 5개 기관(1.8%)을 제외한 모든 기관이 모든 검체에 대해 정확한 정성 결과값을 보고하였다. 3기관(1.1%)은 음성 검체를 위양성으로 보고하였고, 1기관(0.4%)은 하나의 중간 농도 양성을 위음성으로 보고하였으며, 다른 1개 기관은 하나의 낮은 농도 양성 검체를 위음성으로 보고하였다. 2차 숙련도조사에서는 2개 기관(0.7%)을 제외한 모든 기관이 정확하게 답변하였다. 1개 기관은 음성 검체를 위양성으로 보고하였고, 나머지 1개 기관은 중간 농도 양성 검체를 위음성으로 보고하였다.

검사실 내 Ct 변화를 비교하였을 때, 1차에서는 7기관(2.5%)에서 낮은 농도 양성 검체들의 Ct값 차이가 >1.66이었으나, 2차에서는 10기관(3.3%)에서 낮은 농도 양성 검체들의 Ct값 차이가 >1.66이었으며, 5기관(1.6%)에서 중간 농도 양성 검체들의 Ct값 차이가 >1.66이었다(Fig. 1). 대한진단검사정도관리협회에서 바이러스 분자검사 1 신빙도조사사업에 참여하고 있는 기관과 바이러스 분자검사 1 신빙도조사사업에 참여하고 있지 않은 기관의 검사실 내 Ct값 차이를 비교하였을 때, 1차와 2차 모두 두 군에서 유의한 차이가 없었다.

Figure 1. Intralaboratory variations of the E gene cycle threshold (Ct) for mid-level positive (A, C) and low-level positive (B, D) samples. A and B show the results of the first challenge, and C and D show the results of the second challenge. The intralaboratory variation was calculated as the difference between the Ct values of the E gene target from the same sample in the same laboratory. The laboratories with false-negatives for each sample were excluded.

많은 수의 검사실에서 사용하는 두 개의 시약인 SDBiosensors STANDARD M nCoV Real-Time Detection Kit와 Seegene Allplex SARS-CoV-2 Assay의 1차와 2차 숙련도조사에서 검사실 간 Ct값 차이는 Fig. 2와 Fig. 3에 각각 나타내었다. 중간 농도 양성 검체의 E 유전자 Ct값 범위는 STANDARD M 시약을 사용한 경우 1차에서 25–31, 2차에서 25–30 (P=0.701) 인데 비해, Allplex 시약을 사용한 경우는 1차에서 29–33, 2차에서 29–34 (P=0.199)였다. 낮은 농도 양성 검체의 E 유전자 Ct값 범위는 STANDARD M 시약을 사용한 경우 1차에서 27–35, 2차에서 27–35 (P=0.401)이었고, Allplex 시약을 사용한 경우 1차에서 32–37, 2차에서 32–37 (P=0.232)이었다.

Figure 2. Comparison of the E gene cycle threshold (Ct) values by extraction reagent for laboratories using the Standard M nCoV Real-Time Detection Kit (No. 94; A, C) and the Allplex SARS-CoV-2 Assay (No. 56; B, D) in the first challenge. Mid-level positive samples using Standard M reagents (A) and Allplex reagents (B). Low-level positive samples using Standard M reagents (C) and Allplex reagents (D). Extraction kits: 1, Genolution Viral NA kit; 2, AdvanSure R; 3, Seegene STARMag; 4, TANBead optipure prep; 5, Libex Viral DNA and RNA Extraction Kit; 6, Viral Nucleic Acid, Small or Large Volume Kit; 7, Real-Prep Viral DNA/RNA kit; 8, Alphagene Nucleic Acid Extraction Kit; 9, Seegene proprep; 10, QIAamp Viral RNA Mini Kit; 11, QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit; 12, NucleiSens easyMAG; 13, PANAMAX Viral DNA/RNA Extraction Kit; 14, Chemagic Viral DNA/RNA 300 Kit; 15, RADI 32 Viral DNA/RNA Extraction Kit; 16, Smart Lab Assist extraction kit; and 17, others.

Figure 3. Comparison of the E gene cycle threshold (Ct) values by extraction reagent for laboratories using the Standard M nCoV Real-Time Detection Kit (No. 96) and the Allplex SARS-CoV-2 Assay (No. 53) in the second challenge. Mid-level positive samples using Standard M reagents (A) and Allplex reagents (B). Low-level positive samples using Standard M reagents (C) and Allplex reagents (D). Extraction kits: 1, Genolution Viral NA kit; 2, AdvanSure R; 3, Seegene STARMag; 4, TANBead optipure prep; 5, Libex Viral DNA and RNA Extraction Kit; 6, Viral Nucleic Acid, Small or Large Volume Kit; 7, Real-Prep Viral DNA/RNA kit; 8, Alphagene Nucleic Acid Extraction Kit; 9, Seegene proprep; 10, QIAamp Viral RNA Mini Kit; 11, QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Kit; 12, NucleiSens easyMAG; 13, PANAMAX Viral DNA/RNA Extraction Kit; 15, RADI 32 Viral DNA/RNA Extraction Kit; 16, Smart Lab Assist extraction kit; 17, QIAcube reagent; 18, AccuPrep Viral RNA Extraction kit; 19, EZ1 Advanced XL RNA Card; and 20, others.

이 연구를 통해 SARS-CoV-2 진단을 위해 사용하는 PCR 검사의 국내 현황과 정확도를 확인할 수 있었다. 대한진단검사정도관리협회의 신빙도조사사업에 참여하는 검사실들은 소수의 기관을 제외하고는 신뢰할 만한 수준의 SARS-CoV-2 분자진단 결과를 제공하고 있으며, 약 95%의 검사실은 동일한 검체에서 허용 가능한 변이(≤1.66) 내 Ct값을 보고하였다. 변동성이 큰 낮은 농도 양성 검체를 포함하더라도 허용 가능한 검사실 내 변이를 보인 기관은 전체 기관 중 1차 7기관, 2차 14기관으로 5% 이하였다. 2022년 1차와 2차 신빙도조사사업에 참여하는 기관 수가 278기관에서 301기관으로 증가하였으며, 많이 사용하는 추출시약과 PCR 시약의 종류도 바뀌고 있는 것을 확인할 수 있었다[8].

이번 신빙도조사사업에서는 1차에서 5기관, 2차에서 2기관을 제외하고 모든 기관이 정확한 정성 결과값을 보고하였다. 위양성 결과를 보고한 4기관 중 2기관은 하나의 유전자에서만 양성을 보였고, 나머지 2기관은 표적 유전자 모두 양성을 보였다. 표적 유전자 모두 양성을 보인 2기관 중 1기관은 두 유전자 모두 Ct값이 29 정도로 교차오염이나 검체 바뀜 등의 오류가 의심되었다. 나머지 3기관은 교차오염, 비특이적 양성 신호, 사무적 오류 등으로 판단하였다[11,12]. 반면, 위음성 결과를 보고한 기관들의 경우에는 3기관 중 2기관은 표적 유전자 중 하나에서만 음성을 보였으나, 1개 기관은 검사된 표적 유전자 모두 음성이었다. 표적 유전자 중 하나에서만 양성을 보인 경우 임상적인 상황에서는 표적 부위의 변이 등에 의한 PCR drop-out 등을 우선 의심할 수 있겠으나[13,14], 신빙도조사에 이용되는 표준물질에서는 가능성이 떨어진다. 신빙도조사사업에서 표적 유전자 중 하나에서만 음성을 보인 1개 기관에서는 사무상 오류가 의심되었고 나머지 1건에서는 시약의 낮은 민감도 또는 PCR 시약의 불안정성 등이 의심되었다[15]. 모두 음성을 보인 기관은 추출 오류, 시약의 낮은 민감도, 검체 바뀜 등을 의심할 수 있었다. 따라서 두 가지 이상의 표적을 갖는 PCR 검사가 위음성을 배제하는 데 도움이 된다는 것을 다시 확인할 수 있었으며, 위양성이나 위음성을 배제하기 위해서 검체 채취부터 시작해서 추출, PCR 전 과정과 결과보고까지 엄격하게 관리해야 되겠다.

검사실 내 변이는 대부분의 검사실에서 허용 가능한 수준이었다. 국내의 이전 보고와 이번 연구결과를 고려할 때 대부분의 국내 검사실들은 동일 검체에 대해서 신뢰할 만한 수준의 Ct값을 보고하였다. 비록 Ct값의 검사실 내 변이는 허용범위 내에 유지되었지만, 검체 채취과정에서의 변이와 검사자 간 변이 등을 고려할 때[3,16], Ct값을 coronavirus disease 2019 환자의 임상적 경과 추적에 사용하는 것은 주의가 필요하다. 우리나라에서 많이 사용되는 두 PCR 시약의 Ct값은 최대 8까지 검사실 간 차이를 보였다. 또한 추출에 사용되는 검체 양, 추출방법 등에 따라서도 Ct값 차이가 컸다[5,6]. 그러나 이 연구와 이전 연구들에서 보듯이 동일한 추출시약과 PCR 시약을 사용하더라도 검사실 간 Ct값 편차가 크다는 것을 알 수 있어서[7,8], Ct값을 환자의 치료에 대한 반응을 평가하는 데 직접적으로 사용하는 것은 권장되지 않는다[3,4]. 동일한 PCR 시약과 추출시약을 사용하였더라도 다른 기관에서 보고된 Ct값은 임상의에게 주의하여 해석해야 함을 권고해야 한다.

이 연구의 한계점으로, 첫째는 Ct값 20 이하의 높은 바이러스 농도를 갖는 양성 검체를 포함하지 않아서, 교차오염으로 인한 위양성이 적절하게 평가되지 않았다. 둘째로는 4개 회사에서 제조한 시약이 총 기관의 85% 이상에서 사용되기 때문에 다양한 PCR 시약에 대한 검사실 내 혹은 검사실 간 변이를 충분히 검토하지 못했다. 향후 SARS-CoV-2 이외의 공중보건에 큰 영향을 미치는 influenza 등의 호흡기 바이러스에 대해서도 Ct값 결과를 받는 반정량적인 신빙도조사사업을 도입하여 검사실 내 검사실 간 변이를 평가하는 것이 필요하다.

결론적으로, SARS-CoV-2 rRT-PCR 검사의 전반적인 성능과 검사실 내 변이는 대부분의 참여 검사실에서 허용 가능한 수준이었다. 숙련도조사를 통해 검사실의 검사 정확도만을 평가하는 것이 아니라 시약과 추출방법을 포함한 SARS-CoV-2 rRT-PCR 검사의 전반적인 과정을 확인할 수 있었다. 그러나 Ct값의 검사실 간 변이가 현저하기 때문에 다른 기관의 결과를 해석할 때 주의가 필요하겠다.

이 연구는 질병관리청의 2022년도 감염병병원체 확인기관 실험실 검사능력 평가사업으로 수행되었다.