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pISSN 2950-9114 eISSN 2950-9122
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Report On Proficiency Testing

Lab Med Qual Assur 2024; 46(3): 115-129

Published online September 30, 2024

https://doi.org/10.15263/jlmqa.2024.46.3.115

Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.

Report of the Korean Association of External Quality Assessment Service on Next-Generation Sequencing-Based Liquid Biopsy (2020–2023)

Jeayeon Ryu1 , Joonsang Yu1 , Jinyoung Hong2 , Sollip Kim1 , Woochang Lee1 , and Sail Chun1

1Department of Laboratory Medicine, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine; 2Samkwang Medical Laboratories, Seoul, Korea

Correspondence to:Woochang Lee
Department of Laboratory Medicine, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, 88 Olympic-ro 43-gil, Songpa-gu, Seoul 05505, Korea
Tel +82-2-3010-4506
E-mail wlee1@amc.seoul.kr

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

Go to

Next-generation sequencing (NGS)-based liquid biopsy using peripheral blood offers a minimally invasive approach to detect tumor-derived circulating tumor DNA (ctDNA). Given the low abundance of ctDNA, accurate analysis is crucial, necessitating external quality assessments. Since 2020, the Korean Association of External Quality Assessment Service has conducted proficiency testing for NGS-based liquid biopsy. This study reviews the proficiency testing results from 2020 to 2023. The program was conducted biannually. Specimens were created by spiking fragmented DNA into fresh frozen plasma to simulate actual clinical samples. The number of target genes reported increased from 5 in 2020 to 17 in 2023. Results were assessed based on concordance with those obtained from targeted NGS panel testing performed before shipping the manufactured specimens. Participating laboratories used various NGS instruments and reagents. The read depth for each genetic variant varied across laboratories, while the reported read percentage of detected variants was generally consistent. Most laboratories accurately reported variants; however, some discrepancies related to variant position descriptions or incorrect reference sequence transcripts were noted. This study evaluates the performance of Korean clinical laboratories in NGS-based liquid biopsy. Continued vigilance in result reporting is necessary, and ongoing external quality assessments can enhance the reliability of NGS-based liquid biopsy testing.

Keywords: Liquid biopsy, Next-generation sequencing, Circulating tumor DNA, Laboratory proficiency testing

서론

Go to

종양은 정상세포가 여러 체성 변이를 획득하면서 발생하게 된다[1,2]. 종양의 분자 생물학적 검사를 통해 이러한 변이를 확인할 수 있고, 이에 따라 치료를 최적화할 수 있어, 최근 종양에서의 체성 변이 검출이 중요하게 여겨지고 있다[3]. 기존의 조직 생검을 기반으로 한 차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS)은 샘플 채취의 한계가 있어, 최근 혈액이나 체액을 이용한 액체 생검 기반의 NGS 사용이 증가하고 있다[4].

혈중 존재하는 세포 유래 DNA (cell free DNA, cfDNA)는 대부분 혈구로부터 유리되며, 액체 생검의 대상이 되는 순환종양 유래 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)의 분율은 종양의 단계에 따라 매우 다양하게 나타난다[5]. 특히 종양의 초기 단계에서는 대부분 1% 미만으로 낮은 경우가 빈번하다. 이에 ctDNA의 높은 검출 민감도가 요구되고, 검출되었을 때 판독자의 적절한 분석이 중요하다. 따라서 검사의 신뢰도를 높이기 위해 DNA를 추출하는 단계부터 데이터 분석 단계까지 전체 과정을 포함하는 외부정도관리가 시행되어야 한다.

대한진단검사정도관리협회에서는 2020년 시범사업을 시작으로 액체 생검 차세대 염기서열 분석 신빙도조사사업을 시행하고 있다. 2020년부터 2023년까지 시행된 액체 생검 차세대 염기서열 분석 신빙도조사 결과를 분석하여 보고하고자 한다.

재료 및 방법

Go to

1. 조사 항목

액체 생검 NGS 프로그램은 연 2회에 걸쳐서 시행하였다. 검사하여야 할 대상 유전자 변이 위치를 안내하고, 참여한 기관에서 실시하는 NGS panel에 포함된 유전자 변이만 보고하도록 하였다. 보고하여야 하는 유전자 개수는 2020년에 5개에서 2023년에 17개로, 변이의 개수는 9개에서 23개로 증가하였다. 염기변이가 존재하는 경우, 염기 및 아미노산의 변화를 주어진 reference sequence (RefSeq) transcript에 따라 기술하고, 자세한 nomenclature는 Human Genome Variation Society (HGVS)의 최신 권고안을 참고하여 보고하도록 하였다. Read depth는 염기변이 존재 여부와 관계없이 입력하고, 검출된 변이에 대해 variant read percentage를 입력하도록 하였다.

2. 외부 신빙도조사용 정도관리물질

검체의 제조는 서울아산병원에서 수행하였다. 제조방법은 이전에 본 기관에서 보고하였던 방법을 따랐다[6]. 주요 체성 변이들을 포함하고 있는 세포주를 배양하고, QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 각 세포주의 genomic DNA를 변이의 조합을 고려하여 혼합하고, 증류수에 희석한 뒤 ultrasonicator (ME220 Focused ultrasonicator; Covaris Inc., Woburn, MA, USA)를 이용하여 shearing하였다. 신선동결 혈장에 분절화된 DNA를 첨가하고, 균질화한 뒤 각각 소분하여 −70℃에 냉동시켜 외부정도관리물질을 제조하였다. 검체를 발송하기 전에 targeted NGS panel 검사를 시행하여 의도한 체성 변이가 검출되는 것을 확인하였다.

3. 결과 판정

결과 판정은 제조한 검체를 발송하기 전에 시행한 targeted NGS panel 검사결과를 신뢰할 만한 정답으로 하였으며, 정답과의 일치 여부로 판단하였다.

결과

Go to

액체 생검 차세대 염기서열 분석 신빙도조사사업에 참여한 기관의 수는 2020년에 4개 기관에서 2023년에는 12개 기관으로 증가하였다. 참여기관들이 사용하는 장비는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)의 Ion S5, Ion S5 XL 또는 Illumina (San Diego, CA, USA)의 NextSeq, NovaSeq으로 다양하였다. 또한 사용하는 시약 역시 기관마다 상이하여 Thermo Fisher Scientific, Illumina, ArcherDx (Boulder, CO, USA), Dxome (Seongnam, Korea), IMBDX (Seoul, Korea), Roche Diagnostics (Basel, Switzerland)의 제품이 사용되었다.

참여한 기관에서 실시하는 NGS 검사 panel에 포함된 유전자 변이만 보고하도록 하였는데, 2020년 시범사업 때부터 포함시켰던 유전자 5개(BRAF, EGFR, KRAS, PIK3CA, TP53)에 대해서는 모든 기관에서 결과를 보고하였다. 점차 신빙도조사에 포함시킨 유전자의 개수를 늘려, 처음 5개에서 17개로 증가하였다. 이에 기관마다 NGS panel의 구성 유전자 및 분석범위가 상이하여, 모든 유전자에 대해 보고하지 못하는 기관들이 존재하였다. 그러나 신빙도조사 회차가 지날수록 기관에서 보고 대상 유전자 범위가 증가하는 추세를 보였다.

보고된 변이 결과는 각 연도별로 표로 정리하였다(Tables 1–4). 대부분의 기관은 HGVS 권고안에 따라 변이를 정확하게 기술하였다. 그러나 잘못된 변이를 기술한 사례는 각 연도별로 1건씩 총 4건이 있었다. 이 중 3건은 염기 위치와 변이를 잘못 기술한 경우였고, 1건은 보고하도록 제시한 것과 다른 RefSeq transcript를 사용하여 발생한 오류였다. 그 외에 unacceptable로 분류된 사례는 입력 오류에 해당하였다. 2020년도 1차 신빙도조사에서 2번째 검체(GNL-20-02)의 대부분의 변이를 검출하지 못하는 기관의 수가 절반가량 있었으나, 바로 그해 2차 신빙도조사에서는 모든 기관에서 변이를 검출하였다(Table 1). 2021년도 1차 조사에서는 KRAS 유전자 변이를 검출하지 못한 기관이 1건(Table 2), 2022년도 1차 조사에서 FLT3 유전자 변이를 검출하지 못한 기관이 1건 있었다(Table 3). 2023년도 1차 조사에서는 PALB2 유전자 2건, 그리고 2차 조사에서는 FLT3와 MSH2 유전자 변이를 검출하지 못한 기관이 각각 1건으로 확인되었다(Table 4).

Table 1 . Results of NGS-based liquid biopsy in 2020

TrialsGeneVariantDescriptionNo. of labs (%)
1st GNL-20-01BRAFDetectedNM_004333.4(BRAF):c.1799T>A (p.Val600Glu)2 (50.0)
NM_004333.6(BRAF):c.1799T>A (p.Val600Glu)1 (25.0)
c.1799T>A, p.Val600Glu1 (25.0)
EGFR (1)DetectedNM_005228.3(EGFR):c.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2235_2249del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del1 (25.0)
EGFR (2)Detectedc.2300_2308dup, p.Ala767_Val769dup1 (25.0)
NM_005228.3(EGFR):c.2300_2308dup (p.Ala767_Val769dup)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2300_2308dup (p.Ala767_Val769dup)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2300_2308dupTGGCCAGCG (p.Ala767_Val769dup)1 (25.0)
EGFR (3)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2369C>T (p.Thr790Met)2 (50.0)
NM_005228.3(EGFR):c.2369C>T (p.Thr790Met)1 (25.0)
c.2369C>T, p.Thr790Met1 (25.0)
EGFR (4)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2573T>G (p.Leu858Arg)2 (50.0)
NM_005228.3(EGFR):c.2573T>G (p.Leu858Arg)1 (25.0)
c.2573T>G, p.Leu858Arg1 (25.0)
KRASDetectedNM_004985.5(KRAS):c.35G>A (p.Gly12Asp)2 (50.0)
NM_004985.3(KRAS):c.35G>A (p.Gly12Asp)1 (25.0)
c.35G>A, p.Gly12Asp1 (25.0)
NRAS (1)DetectedNM_002524.5(NRAS):c.181C>A (p.Gln61Lys)2 (50.0)
NM_002524.4(NRAS):c.181C>A (p.Gln61Lys)1 (25.0)
c.181C>A, p.Gln61Lys1 (25.0)
NRAS (2)DetectedNM_002524.5(NRAS):c.175G>A (p.Ala59Thr)2 (50.0)
NM_002524.4(NRAS): c.175G>A (p.Ala59Thr)1 (25.0)
c.175G>A, p.Ala59Thr1 (25.0)
PIK3CADetectedNM_006218.4(PIK3CA):c.1633G>A (p.Glu545Lys)1 (25.0)
NM_006218.2(PIK3CA):c.1633G>A (p.Glu545Lys)1 (25.0)
c.1633G>A, p.Glu545Lys1 (25.0)
Not detected-1 (25.0)
1st GNL-20-02BRAFDetectedNM_004333.4(BRAF):c.1799T>A (p.Val600Glu)2 (50.0)
NM_004333.6(BRAF):c.1799T>A (p.Val600Glu)1 (25.0)
c.1799T>A, p.Val600Glu1 (25.0)
EGFR (1)DetectedNM_005228.3(EGFR):c.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2235_2249del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
Not detected-2 (50.0)
EGFR (2)Not detected-4 (100.0)
EGFR (3)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2369C>T (p.Thr790Met)1 (25.0)
NM_005228.3(EGFR):c.2369C>T (p.Thr790Met)1 (25.0)
c.2369C>T, p.Thr790Met1 (25.0)
Not detected-1 (25.0)
EGFR (4)Detectedc.2573T>G, p.Leu858Arg1 (25.0)
Not detected-3 (75.0)
KRASDetectedNM_004985.3(KRAS):c.35G>A (p.Gly12Asp)1 (25.0)
35G>A, p.Gly12Asp1 (25.0)
Not detected-2 (50.0)
NRAS (1)DetectedNM_002524.5(NRAS):c.181C>A (p.Gln61Lys)1 (25.0)
c.181C>A, p.Gln61Lys1 (25.0)
Not detected-2 (50.0)
NRAS (2)DetectedNM_002524.4(NRAS): c.175G>A (p.Ala59Thr)1 (25.0)
Not detected-3 (75.0)
PIK3CADetectedNM_006218.4(PIK3CA):c.1633G>A (p.Glu545Lys)1 (25.0)
Not detected-3 (75.0)
2nd GNL-20-03BRAFNot detected-4 (100.0)
EGFR (1)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)2 (50.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2235_2249del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
EGFR (2)Not detected-4 (100.0)
EGFR (3)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2573T>G (p.Leu858Arg)4 (100.0)
KRASDetectedNM_004985.5(KRAS):c.34G>T (p.Gly12Cys)4 (100.0)
PIK3CANot detected-4 (100.0)
TP53 (1)Not detected-4 (100.0)
TP53 (2)DetectedNM_000546.5(TP53):c.743G>A (p.Arg248Gln)3 (75.0)
NM_000546.6(TP53):c.743G>A (p.Arg248Gln)1 (25.0)
TP53 (3)Not detected-4 (100.0)
TP53 (4)DetectedNM_000546.5(TP53):c.560-1G>A2 (50.0)
NM_000546.5(TP53):c.560-1G>A (p.?)1 (25.0)
NM_000546.5(TP53):c.560-1G>C1 (25.0)
2nd GNL-20-04BRAFDetectedNM_004333.4(BRAF):c.1799T>A (p.Val600Glu)3 (75.0)
NM_004333.4(BRAF):c.1799T>A, (p.Val600Glu)1 (25.0)
EGFR (1)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)2 (50.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2236_2250del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
NM_005228.5(EGFR):c.2236_2250delGAATTAAGAGAAGCA (p.Glu746_Ala750del)1 (25.0)
EGFR (2)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2369C>T (p.Thr790Met)4 (100.0)
EGFR (3)DetectedNM_005228.5(EGFR):c.2573T>G (p.Leu858Arg)3 (75.0)
NM_005228.5(EGFR)c.2573T>G (p.Leu858Arg)1 (25.0)
KRASNot detected-4 (100.0)
PIK3CADetectedNM_006218.4(PIK3CA):c.353G>A (p.Gly118Asp)4 (100.0)
TP53 (1)DetectedNM_000546.5(TP53):c.818G>A (p.Arg273His)4 (100.0)
TP53 (2)Not detected-4 (100.0)
TP53 (3)DetectedNM_000546.5(TP53):c.742C>G (p.Arg248Gly)4 (100.0)
TP53 (4)Not detected-4 (100.0)

Bold lettering indicates results that are not compliant with the intended responses.

Abbreviation: NGS, next-generation sequencing.

Table 2 . Results of NGS-based liquid biopsy in 2021

TrialsGeneVariantDescriptionNo. of labs (%)
1st GNL-21-01BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)4 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)5 (100.0)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)5 (100.0)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)4 (100.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)4 (80.0)
Not detected-1 (20.0)
PIK3CADetectedc.353G>A (p.Gly118Asp)5 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)4 (100.0)
TP53 (2)Not detected-4 (100.0)
TP53 (3)Detectedc.742C>G (p.Arg248Gly)5 (100.0)
TP53 (4)Not detected-5 (100.0)
1st GNL-21-02BRAFNot detected-4 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)3 (60.0)
c.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)2 (40.0)
EGFR (2)Not detected-5 (100.0)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)4 (100.0)
KRASDetectedc.34G>T (p.Gly12Cys)5 (100.0)
PIK3CANot detected-5 (100.0)
TP53 (1)Not detected-4 (100.0)
TP53 (2)Detectedc.743G>A (p.Arg248Gln)4 (100.0)
TP53 (3)Not detected-5 (100.0)
TP53 (4)Detectedc.560-1G>A4 (80.0)
c.560-1G>A (p.?)1 (20.0)
2nd GNL-21-03APCDetectedc.5947G>T (p.Glu1983Ter)3 (75.0)
c.5947G>T p.Glu1983Ter1 (25.0)
BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)5 (83.3)
c.1799T>A p.Val600Glu1 (16.7)
CDKN2A (1)Not detected-4 (100.0)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)3 (75.0)
c.200G>T p.Gly67Val1 (25.0)
CTNNB1Not detected-4 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)5 (83.3)
c.2235_2249del p.Glu746_Ala750del1 (16.7)
EGFR (2)Not detected-6 (100.0)
EGFR (3)Not detected-6 (100.0)
FGFR3Not detected-4 (100.0)
FLT3Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)3 (75.0)
c.969C>A p.Asn323Lys1 (25.0)
KITDetectedc.878A>G (p.Asn293Ser)3 (75.0)
c.878A>G p.Asn293Ser1 (25.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)5 (83.3)
c.34G>A p.Gly12Ser1 (16.7)
MLH1Detectedc.311del (p.Leu104TrpfsTer4)2 (50.0)
c.311del p.Leu104TrpfsTer41 (25.0)
c.311delT (p.Leu104TrpfsTer4)1 (25.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)2 (100.0)
PIK3CANot detected-6 (100.0)
STK11Detectedc.109C>T (p.Gln37Ter)3 (75.0)
c.109C>T p.Gln37Ter1 (25.0)
TP53 (1)Not detected-4 (100.0)
TP53 (2)Detectedc.742C>G (p.Arg248Gly)5 (83.3)
c.742C>G p.Arg248Gly1 (16.7)
2nd GNL-21-04APCNot detected-4 (100)
BRAFNot detected-6 (100.0)
CDKN2A (1)Detectedc.205G>T (p.Glu69Ter)3 (75.0)
c.205G>T p.Glu69Ter1 (25.0)
CDKN2A (2)Not detected-4 (100.0)
CTNNB1Detectedc.223A>G (p.Thr75Ala)3 (75.0)
c.223A>G p.Thr75Ala1 (25.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)5 (83.3)
c.2235_2249del p.Glu746_Ala750del1 (16.7)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)5 (83.3)
c.2369C>T p.Thr790Met1 (16.7)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)5 (83.3)
c.2573T>G p.Leu858Arg1 (16.7)
FGFR3Detectedc.101G>A (p.Arg34Gln)3 (75.0)
c.101G>A p.Arg34Gln1 (25.0)
FLT3Not detected-4 (100.0)
KITNot detected-4 (100.0)
KRASDetectedc.34G>T (p.Gly12Cys)5 (83.3)
c.34G>T p.Gly12Cys1 (16.7)
MLH1Not detected-4 (100.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)2 (100.0)
PIK3CADetectedc.353G>A (p.Gly118Asp)5 (83.3)
c.353G>A p.Gly118Asp1 (16.7)
STK11Not detected-4 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)5 (83.3)
c.818G>A p.Arg273His1 (16.7)
TP53 (2)Not detected-6 (100.0)

Bold lettering indicates results that are not compliant with the intended responses.

Abbreviation: NGS, next-generation sequencing.

Table 3 . Results of NGS-based liquid biopsy in 2022

TrialsGeneVariantDescriptionNo. of labs (%)
1st GNL-22-01APCNot detected-5 (100.0)
BRAFNot detected-8 (100.0)
CDKN2A (1)Detectedc.205G>T (p.Glu69Ter)3 (60.0)
c.205G>T (p.Glu69*)2 (40.0)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)5 (100.0)
CTNNB1Detectedc.223A>G (p.Thr75Ala)6 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)6 (75.0)
c.2235_2249del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (12.5)
c.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)1 (12.5)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)8 (100.0)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)8 (100.0)
FGFR1Detectedc.626G>A (p.Arg209His)5 (100.0)
FGFR3Detectedc.101G>A (p.Arg34Gln)5 (100.0)
FLT3Not detected-4 (80.0)
Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)1 (20.0)
KITDetectedc.878A>G (p.Asn293Ser)5 (100.0)
KRASDetectedc.34G>T (p.Gly12Cys)8 (100.0)
MLH1Detectedc.311del (p.Leu104TrpfsTer4)3 (60.0)
c.311del (p.Leu104Trpfs*4)1 (20.0)
c.311delT (p.Leu104Trpfs*4)1 (20.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)2 (100.0)
PIK3CADetectedc.353G>A (p.Gly118Asp)8 (100.0)
STK11Not detected-5 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)8 (100.0)
TP53 (2)Detectedc.743G>A (p.Arg248Gln)8 (100.0)
TP53 (3)Not detected-8 (100.0)
1st GNL-22-02APCDetectedc.5947G>T (p.Glu1983Ter)3 (60.0)
c.5947G>T (p.Glu1983*)1 (20.0)
c.5947G>T(p.Glu1983*)1 (20.0)
BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)7 (87.5)
c.1799T>A(p.Val600Glu)1 (12.5)
CDKN2A (1)Not detected-5 (100.0)
CDKN2A (2)Not detected-5 (100.0)
CTNNB1Not detected-6 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)7 (87.5)
c.2236_2250del15 (p.Glu746_Ala750del)1 (12.5)
EGFR (2)Not detected-8 (100.0)
EGFR (3)Not detected-8 (100.0)
FGFR1Not detected-5 (100.0)
FGFR3Not detected-5 (100.0)
FLT3Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)4 (80.0)
Not detected-1 (20.0)
KITNot detected-5 (100.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)7 (87.5)
c.34G>A(p.Gly12Ser)1 (12.5)
MLH1Not detected-5 (100.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)2 (100.0)
PIK3CANot detected-8 (100.0)
STK11Detectedc.109C>T (p.Gln37Ter)3 (60.0)
c.109C>T (p.Gln37*)2 (40.0)
TP53 (1)Not detected-8 (100.0)
TP53 (2)Not detected-8 (100.0)
TP53 (3)Detectedc.742C>G (p.Arg248Gly)8 (100.0)
2nd GNL-22-03APCNot detected-6 (100.0)
BRAFNot detected-9 (100.0)
CDKN2A (1)Detectedc.205G>T (p.Glu69*)1 (16.7)
c.205G>T (p.Glu69Ter)5 (83.3)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)6 (100.0)
CTNNB1Detectedc.223A>G (p.Thr75Ala)7 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)9 (100.0)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)9 (100.0)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)9 (100.0)
FGFR1Not detected-6 (100.0)
FGFR3Not detected-6 (100.0)
FLT3Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)6 (100.0)
KITNot detected-6 (100.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)9 (100.0)
MLH1Not detected-6 (100.0)
PALB2Not detected-5 (100.0)
PIK3CA (1)Detectedc.353G>A (p.Gly118Asp)9 (100.0)
PIK3CA (2)Not detected-8 (100.0)
STK11Detectedc.109C>T (p.Gln37Ter)5 (83.3)
c.109C>T (p.Gln37*)1 (16.7)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)9 (100.0)
TP53 (2)Not detected-9 (100.0)
2nd GNL-22-04APCDetectedc.2557G>T (p.Glu853Ter)4 (66.7)
c.2557G>T(p.Glu853Ter)1 (16.7)
c.2557G>T (p.Glu853*)1 (16.7)
BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)8 (100.0)
CDKN2A (1)Not detected-6 (100.0)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)6 (100.0)
CTNNB1Detectedc.223A>G (p.Thr75Ala)7 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)7 (77.8)
c.2235_2249del(p.Glu746_Ala750del)1 (11.1)
c.2235_2249del (p.Glu476_Ala750del)1 (11.1)
EGFR (2)Not detected-9 (100.0)
EGFR (3)Not detected-9 (100.0)
FGFR1Detectedc.626G>A (p.Arg209His)6 (100.0)
FGFR3Detectedc.101G>A (p.Arg34Gln)6 (100.0)
FLT3Not detected-6 (100.0)
KITDetectedc.878A>G (p.Asn293Ser)6 (100.0)
KRASDetectedc.34G>T (p.Gly12Cys)9 (100.0)
MLH1Detectedc.311del (p.Leu104TrpfsTer4)4 (66.7)
c.311del(p.Leu104TrpfsTer4)1 (16.7)
c.311del (p.Leu104Trpfs*4)1 (16.7)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)5 (100.0)
PIK3CA (1)Not detected-9 (100.0)
PIK3CA (2)Detectedc.1345C>A (p.Pro449Thr)8 (100.0)
STK11Not detected-6 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)9 (100.0)
TP53 (2)Detectedc.743G>A (p.Arg248Gln)9 (100.0)

Bold lettering indicates results that are not compliant with the intended responses.

Abbreviation: NGS, next-generation sequencing.

Table 4 . Results of NGS-based liquid biopsy in 2023

TrialsGeneVariantDescriptionNo. of labs (%)
1st GNL-23-01APC (1)Detectedc.2557G>T (p.Glu853*)4 (44.4)
c.2557G>T (p.Glu853Ter)4 (44.4)
c.2557G>T(p.Glu853Ter)1 (11.1)
APC (2)Detectedc.5947G>T (p.Glu1983*)4 (44.4)
c.5947G>T (p.Glu1983Ter)4 (44.4)
c.5947G>T(p.Glu1983Ter)1 (11.1)
BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)10 (83.3)
c.1799T>A(p.Val600Glu)1 (8.3)
c.1799T>A (p.V600E)1 (8.3)
CDKN2A (1)Not detected-9 (100.0)
CDKN2A (2)Not detected-9 (100.0)
CTNNB1Not detected-9 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)10 (83.3)
c.2236_2250del(p.Glu746_Ala750del)1 (8.3)
c.2236_2250delGAATTAAGAGAAGCA (p.E746_A750del)1 (8.3)
EGFR (2)Not detected-12 (100.0)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)10 (83.3)
c.2573T>G(p.Leu858Arg)1 (8.3)
c.2573T>G (p.L858R)1 (8.3)
FGFR1Not detected-9 (100.0)
FGFR3Not detected-9 (100.0)
FLT3Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)8 (88.9)
c.969C>A(p.Asn323Lys)1 (11.1)
KITNot detected-9 (100.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)10 (83.3)
c.34G>A(p.Gly12Ser)1 (8.3)
c.34G>A (p.G12S)1 (8.3)
MLH1Not detected-9 (100.0)
MSH2Detectedc.1168C>T (p.Leu390Phe)7 (87.5)
c.1168C>T(p.Leu390Phe)1 (12.5)
NF2Detectedc.385G>T (p.Glu129*)4 (44.4)
c.385G>T (p.Glu129Ter)4 (44.4)
c.385G>T(p.Glu129Ter)1 (11.1)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)7 (87.5)
c.1676A>G(p.Gln559Arg)1 (12.5)
Not detected-1 (11.1)
PIK3CA (1)Not detected-12 (100.0)
PIK3CA (2)Detectedc.1345C>A (p.Pro449Thr)10 (90.9)
c.1345C>A(p.Pro449Thr)1 (9.1)
STK11 (1)Detectedc.109C>T (p.Gln37*)4 (44.4)
c.109C>T (p.Gln37Ter)4 (44.4)
c.109C>T(p.Gln37Ter)1 (11.1)
STK11 (2)Detectedc.647C>T (p.Ser216Phe)8 (88.9)
c.647C>T(p.Ser216Phe)1 (11.1)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)10 (83.3)
c.818G>A(p.Arg273His)1 (8.3)
c.818G>A (p.R273H)1 (8.3)
TP53 (2)Not detected-12 (100.0)
TP53 (3)Detectedc.742C>G (p.Arg248Gly)10 (83.3)
c.742C>G(p.Arg248Gly)1 (8.3)
c.742C>G (p.R248G)1 (8.3)
TP53 (4)Detectedc.560-1G>A (p.?)8 (66.7)
c.560-1G>A3 (25.0)
c.560-1G>A(p.?)1 (8.3)
1st GNL-23-02APC (1)Not detected-9 (100.0)
APC (2)Not detected-9 (100.0)
BRAFNot detected-12 (100.0)
CDKN2A (1)Detectedc.205G>T (p.Glu69*)4 (44.4)
c.205G>T (p.Glu69Ter)4 (44.4)
c.205G>T(p.Glu69Ter)1 (11.1)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)8 (88.9)
c.200G>T(p.Gly67Val)1 (11.1)
CTNNB1Detectedc.223A>G (p.Thr75Ala)8 (88.9)
c.223A>G(p.Thr75Ala)1 (11.1)
EGFR (1)Detectedc.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)10 (83.3)
c.2235_2249del(p.Glu746_Ala750del)1 (8.3)
c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC (p.E746_A750del)1 (8.3)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)10 (83.3)
c.2369C>T(p.Thr790Met)1 (8.3)
c.2573T>G (p.Leu858Arg)10 (83.3)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G(p.Leu858Arg)1 (8.3)
c.2369C>T (p.T790M)1 (8.3)
c.2573T>G (p.L858R)1 (8.3)
FGFR1Detectedc.626G>A (p.Arg209His)7 (77.8)
c.626G>A(p.Arg209His)1 (11.1)
c.719G>A (p.Arg240His)1 (11.1)
FGFR3Detectedc.101G>A (p.Arg34Gln)8 (88.9)
c.101G>A(p.Arg34Gln)1 (11.1)
FLT3Not detected-9 (100.0)
KITDetectedc.878A>G (p.Asn293Ser)7 (87.5)
c.878A>G(p.Asn293Ser)1 (12.5)
KRASDetectedc.34G>T (p.Gly12Cys)10 (83.3)
c.34G>T(p.Gly12Cys)1 (8.3)
c.34G>T (p.G12C)1 (8.3)
MLH1Detectedc.311del (p.Leu104TrpfsTer4)5 (55.6)
c.311del (p.Leu104Trpfs*4)3 (33.3)
c.311del(p.Leu104TrpfsTer4)1 (11.1)
MSH2Not detected-9 (100.0)
NF2Not detected-9 (100.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)7 (87.5)
c.1676A>G(p.Gln559Arg)1 (12.5)
Not detected-1 (11.1)
PIK3CA (1)Detectedc.353G>A (p.Gly118Asp)10 (83.3)
c.353G>A(p.Gly118Asp)1 (8.3)
c.353G>A (p.G118D)1 (8.3)
PIK3CA (2)Not detected-11 (100.0)
STK11 (1)Not detected-9 (100.0)
STK11 (2)Not detected-9 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)10 (83.3)
c.818G>A(p.Arg273His)1 (8.3)
c.818G>A (p.R273H)1 (8.3)
TP53 (2)Detectedc.743G>A (p.Arg248Gln)10 (83.3)
c.743G>A(p.Arg248Gln)1 (8.3)
c.743G>A (p.R248Q)1 (8.3)
TP53 (3)Not detected-12 (100.0)
TP53 (4)Not detected-12 (100.0)
2nd GNL-23-03APCDetectedc.5947G>T (p.Glu1983Ter)6 (66.7)
c.5947G>T (p.Glu1983*)3 (33.3)
BRAFDetectedc.1799T>A (p.Val600Glu)10 (90.9)
c.1799T>A (p.V600E)1 (9.1)
CDKN2A (1)Not detected-9 (100.0)
CDKN2A (2)Not detected-9 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2236_2250del (p.Glu746_Ala750del)10 (90.9)
c.2236_2250delGAATTAAGAGAAGCA (p.E746_A750del)1 (9.1)
EGFR (2)Not detected-11 (100.0)
EGFR (3)Not detected-11 (100.0)
FLT3Detectedc.969C>A (p.Asn323Lys)8 (88.9)
Not detected-1 (11.1)
KITNot detected-9 (100.0)
KRASDetectedc.34G>A (p.Gly12Ser)10 (90.9)
c.34G>A (p.G12S)1 (9.1)
MLH1Not detected-9 (100.0)
MSH2 (1)Detectedc.1168C>T (p.Leu390Phe)9 (100.0)
MSH2 (2)Detectedc.1786_1799delinsT (p.Asn596PhefsTer3)6 (66.7)
c.1786_1799delinsT (p.Asn596Phefs*3)2 (22.2)
Not detected-1 (11.1)
NF2Detectedc.385G>T (p.Glu129Ter)6 (66.7)
c.385G>T (p.Glu129*)3 (33.3)
NRAS (1)Not detected-11 (100.0)
NRAS (2)Detectedc.181C>A (p.Gln61Lys)10 (90.9)
c.181C>A (p.Q61K)1 (9.1)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)9 (100.0)
PIK3CANot detected-11 (100.0)
STK11 (1)Detectedc.109C>T (p.Gln37Ter)6 (66.7)
c.109C>T (p.Gln37*)3 (33.3)
STK11 (2)Detectedc.647C>T (p.Ser216Phe)9 (100.0)
TP53 (1)Not detected-11 (100.0)
TP53 (2)Not detected-11 (100.0)
TP53 (3)Detectedc.742C>G (p.Arg248Gly)10 (90.9)
c.742C>G (p.R248G)1 (9.1)
TP53 (4)Not detected-9 (100.0)
2nd GNL-23-04APCNot detected-9 (100.0)
BRAFNot detected-11 (100.0)
CDKN2A (1)Detectedc.205G>T (p.Glu69Ter)6 (66.7)
c.205G>T (p.Glu69*)3 (33.3)
CDKN2A (2)Detectedc.200G>T (p.Gly67Val)9 (100.0)
EGFR (1)Detectedc.2235_2249del (p.Glu746_Ala750del)10 (90.9)
c.2235_2249delGGAATTAAGAGAAGC (p.E746_A750del)1 (9.1)
EGFR (2)Detectedc.2369C>T (p.Thr790Met)10 (90.9)
c.2369C>T (p.T790M)1 (9.1)
EGFR (3)Detectedc.2573T>G (p.Leu858Arg)10 (90.9)
c.2573T>G (p.L858R)1 (9.1)
FLT3Not detected-9 (100.0)
KITDetectedc.878A>G (p.Asn293Ser)9 (100.0)
KRASNot detected-11 (100.0)
MLH1Detectedc.311del (p.Leu104TrpfsTer4)6 (66.7)
c.311del (p.Leu104Trpfs*4)3 (33.3)
MSH2 (1)Not detected-9 (100.0)
MSH2 (2)Not detected-9 (100.0)
NF2Not detected-9 (100.0)
NRAS (1)Detectedc.182A>G (p.Gln61Arg)10 (90.9)
c.182A>G (p.Q61R)1 (9.1)
NRAS (2)Not detected-11 (100.0)
PALB2Detectedc.1676A>G (p.Gln559Arg)9 (100.0)
PIK3CADetectedc.353G>A (p.Gly118Asp)10 (90.9)
c.353G>A (p.G118D)1 (9.1)
STK11 (1)Not detected-9 (100.0)
STK11 (2)Not detected-9 (100.0)
TP53 (1)Detectedc.818G>A (p.Arg273His)10 (90.9)
c.818G>A (p.R273H)1 (9.1)
TP53 (2)Detectedc.743G>A (p.Arg248Gln)10 (90.9)
743G>A (p.R248Q)1 (9.1)
TP53 (3)Not detected-11 (100.0)
TP53 (4)Detectedc.375G>A (p.Thr125=)9 (100.0)

Bold lettering indicates results that are not compliant with the intended responses.

Abbreviation: NGS, next-generation sequencing.

각 유전자 변이별 read depth는 각 기관마다 그리고 유전자 변이 위치마다 차이를 보였고, 검출된 변이의 read percentage는 2023년도 2차에서 coefficient of variation 약 20% 이내로 모든 기관에서 전반적으로 비슷하게 보고하였다.

고찰

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최근 임상검사실에 도입된 액체 생검 NGS 검사는 종양 환자의 치료와 관리에 중요한 정보를 제공하며 점차 검사를 시행하는 기관 수가 증가하고 있다. 이러한 이유로, 이 검사의 정확도를 검증하기 위한 외부정도관리가 필요하며, 이에 대한진단검사정도관리협회에서 2020년에 처음으로 신빙도조사를 도입하여 시행하고 있다. 본 연구에서는 2020년부터 2023년까지 4년간의 액체 생검 NGS 신빙도조사 결과를 종합하여, 각 연도의 결과와 참여기관 및 유전자 변이 보고의 변화를 분석하였다.

액체 생검의 경우, 검체에서 검출되는 ctDNA의 양이 매우 적기 때문에 DNA 추출과정이 검사 성능에 중요한 영향을 미친다[7]. 따라서 핵산 추출 단계부터 평가할 수 있는 혈장 기반 검체를 사용하는 것이 이상적이다[8]. 검체 제조를 위해 대량의 혈장이 필요하므로, 본 기관에서는 이전에 citrate 항응고제와 임상 검체 채취 시 사용되는 ethylenediaminetetraacetic acid 항응고제를 비교 평가하였다[9]. 그 결과, 수행능에 큰 차이가 없어 citrate 항응고제를 사용한 대량 혈장 검체를 외부정도관리물질 제조에 활용할 수 있었다. 또한 ctDNA는 167 bp의 짧은 길이에 가장 많이 분포하므로[10], 세포주의 genomic DNA를 분절화하여 실제 임상 검체와 유사하게 만들었다.

액체 생검 NGS 신빙도조사사업에서 DNA 추출 단계부터 검사 단계까지 대부분의 기관이 우수한 성과를 보였으며, ctDNA를 감지하지 못하는 경우는 드물었다. 그러나 부적합 판정을 받는 주된 이유 중 하나는 결과 입력 시 염기서열의 단순 오기 또는 오류였다. 이러한 오류를 줄이기 위해서는 결과 입력 시 지속적인 주의가 필요하다. 또 다른 부적합 판정의 이유는 제공된 RefSeq와 다른 accession number를 사용한 것이었다. 각 accession number마다 coding sequence가 달라질 수 있어, 결과 보고 시에는 RefSeq로 사용한 accession number를 항상 명시해야 한다. 또한 HGVS에 따르면, 인간 유전자 변이를 기술할 때는 MANE (Matched Annotation from NCBI and EMBL-EBI) project에서 권장하는 transcript를 사용하도록 하고 있다. 기관 간의 결과 보고의 표준화를 위해서는 권고된 대표적인 accession number를 사용하는 것이 필요하다.

본 연구는 액체 생검 NGS 신빙도조사사업을 통해 국내 여러 기관의 검사 수행능력을 평가하였다. 지속적인 외부정도관리를 통해 액체 생검 NGS의 신뢰성을 강화하고, 궁극적으로 종양 환자 치료에 보다 정확한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

References

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