요결정체는 정상인에서도 흔히 관찰되나, 대사장애, 유전장애가 있거나 약물을 복용한 사람에서도 관찰된다. 정상인에게서 관찰되는 대부분의 요결정체는 임상적 의미가 없는 경우가 많으나, 일부 결정체의 경우 진단, 치료 및 예후 예측에 도움이 되기도 한다. 예를 들면, calcium oxalate monohydrate (COM)는 고칼슘뇨증이나 ethylene glycol 독성을 시사하고 cystine 결정체는 시스틴뇨증의 특징적인 소견이기도 하다[1].

또한 요결정체는 요결석 질환의 위험인자로 여겨지며, 요결석의 생성에 선행될 수 있다. 다만 요결정체가 보이는 사람에게서 반드시 요결석이 생성되는 것은 아니다[2]. 이 때문에 임상검사실에서 정상으로 간주되는 결정체는 잘 보고되지 않는 실정이다. 전 세계적으로 요결석 질환의 연간 발생률이 증가하고 있으며, 국내에서는 평생 유병률이 11.5% 정도로 알려져 있다. 또한 5년 내 재발률이 21.3% 정도로 높게 보고되고 있어 예방, 진단, 치료의 중요성이 부각되고 있다[3,4]. 요결정체는 요결석의 재발을 예측하는 데 도움이 된다. 특히 아침 첫 소변에서 반복적으로 요결정체가 검출되는 환자들의 경우 칼슘결석 환자에서 재발 위험률에 대한 예측이 높았다[5].

1630년도 현미경으로 요결정체가 첫 보고된 이래 다양한 종류의 결정체가 보고되고 검사방법이 정립되었다. 요침사 검사는 pH, 요 비중 등 기본적인 소변 검사결과를 참고하고, 현미경 검경으로 시행하고 있다. 그 중 요결정체는 일반적으로 모양으로 감별하고, 용해도와 편광 강도를 참고하여 이루어지고 있다. 보다 정확한 동정으로 petrographic microscopy, scanning electron microscopy, infrared microscopy 또는 spectrophotometry와 같은 검사가 있지만, 모든 검사실에서 사용하기에는 어려움이 있다[6,7]. 근래에는 자동화된 요 검사장비가 요결정체의 검출이 가능하나, 검출률이 낮고 감별하기 어려워 여전히 검사자의 현미경 검경이 중요하다[8]. 하지만 전형적인 결정체는 모양으로 감별하는 것이 용이하지만 비정형 결정체는 감별이 어렵다. 또한 여러 종류의 결정체가 섞여 있어 결정체의 모양만으로는 감별이 어려운 경우도 있다[7]. 국내에서는 신빙도조사사업에서 요결정체의 모양과 함께 용해도 결과를 제시하고 있으며, 이를 통해 양호한 정답률을 보이고 있다[9]. 모양뿐 아니라 용해도 결과도 감별에 중요한 것이다.

용해도 검사는 결정체 모양이 비슷하거나 전형적이지 않는 경우 등 불확실할 때 이를 감별하기 위해 시행하는 추가적인 검사로 대부분의 검사실에서 간단한 방법으로 시행할 수 있다. 요침사층에 화학 시약 몇 방울만 떨어뜨리고 슬라이드를 제작하여 현미경으로 검경하면 된다[6]. 하지만 문헌에 따라 용해도 차이가 있거나 결과가 부족한 경우도 있다. Calcium oxalate, calcium phosphate, uric acid (UA), purine 및 cystine 등 비교적 흔하게 관찰되는 결정체에 대한 용해도는 있으나, calcium sulfate (CS), hippuric acid (HA), uric acid sodium salt (UASS) 및 xanthine 등은 그 결과를 찾아보기 어렵다[10].

이에 본 연구에서는 순수한 물질을 이용하여 용해도 검사를 시행하여, 임상검사실에서 소변 결정체의 감별을 위한 용해도 결과를 재정립하고자 하였다.

1. 실험대상 물질

실험대상 물질은 총 13개로, calcium carbonate (CC), COM, calcium phosphate dibasic (CPD), CS, cystine, HA, leucine, magnesium ammonium phosphate (triple phosphate, TP), meglumine diatrizoate (contrast media, CM), tyrosine, UA, UASS 및 xanthine이다. 모든 물질은 Sigma사(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다.

모든 물질은 분말의 형태로 되어 있으며, 다양한 모양과 크기의 결정체가 뭉쳐 있는 것이 분말일 것으로 간주하였다. 각 물질별로 분말 자체의 모양과 용액에 현탁 시킨 것을 비교하여 결정체의 본래 형태를 파악하였다.

각 물질의 결정 형태와 편광 강도를 도립현미경(Nikon Eclipse Ti-U; Nikon, Tokyo, Japan)과 편광장치로 배율별(×200, ×400, ×600)로 촬영하였고 NIS Elements BR 4.10.00 64 bit program (Nikon)으로 편집하였다.

용해도를 확인하기 위해 30% acetic acid (AA; Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea), 30% hydrochloric acid (HCl; OCI Co. Ltd., Seoul, Korea), 10% potassium hydroxide (KOH; Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo Japan), 증류수(Daihan Pharm Co. Ltd., Seoul, Korea), 에탄올(Merck KGaA, Darmstadt, Germany), chloroform (Junsei Chemical Co. Ltd.) 및 diethyl ether (Merck KGaA) 등 7가지 용액을 사용했다. 증류수는 추가적으로 항온기(Esco Micro Pte. Ltd., Changi, Singapore)에 10분간 60℃로 가열하여 용해도를 확인했다. 필요한 경우, 용액이 건조된 후의 상태도 검경하여 확인했다.

2. 슬라이드 제작방법 및 현미경 검경

용액 없이 슬라이드 위에 균등하게 올려 둔 분말 형태의 물질을 먼저 검경한 다음, 용액 50 μL를 가한 뒤 잘 혼합하여 30초 후 커버 글라스를 덮고 검경하였다. 물질에 따라서 분말입자가 너무 큰 경우는 그라인더를 이용하여 잘게 부쉈다. 용질이 용액에 녹는 경우 용액이 투명해지는 것을 육안으로 관찰할 수 있었으며, 현미경 검경으로 용질의 형태와 크기, 용해도를 최종 확인하였다. 용해도 실험은 실내 온도 20℃에서 시행하였다.

각 물질의 용해도와 결정체 형태는 기존에 문헌에 보고된 내용을 참고하였고, 실험결과와 비교하였다. 기존에 보고된 용해도 결과와 다른 경우 다른 농도의 용액을 이용하여 용해도 결과를 추가로 확인했다. 용해도 검사결과는 다음과 같은 기준으로 판정하였다. (1) 용해(lysis, +): 결정체의 형태가 용액에 녹아 완전히 사라진 경우, (2) 부분 용해(partial lysis): 결정체가 일부 용해되어 기존 형태가 변형된 경우, (3) 불용해(no lysis, -): 결정체의 형태가 동일하게 유지되는 경우이며 용해도 검사결과는 검사자 간 비교를 통해 결과의 재현성을 확인했다.

13개의 순수한 물질의 결정체 형태와 용해도 결과를 Table 1과 Fig. 1에 요약하였다. CC, COM, CPD, cystine, TP, tyrosine 및 UA 등 7개의 결정체는 기존의 용해도 결과와 동일함을 확인하였다. CC와 TP는 30% AA와 30% HCl에 용해되었으며, CC는 30% AA와 30% HCl에서 기포가 발생하며 용해되었다(Fig. 1B). COM과 CPD는 30% HCl에 용해되었다. Cystine과 tyrosine은 30% HCl과 10% KOH에 용해되었다.

Figure 1. Total thirteen crystals microscopic morphologies were obtained in ethanol (×400). The shapes of crystals are as follows: (A) square and barrel shapes of calcium carbonate, (B) calcium carbonate dissolved with effervescence in 30% acetic acid, (C) irregular granules and small oval shapes of calcium oxalate monohydrate (×900), (D) amorphous granule cluster shapes of calcium phosphate dibasic, (E) elongated rectangle shapes of calcium sulfate, (F) stacked hexagon plates shapes of cystine, (G) elongated hexagons and large irregular shapes cluster shapes of hippuric acid, (H) stacked thin hexagon plates shapes of leucine, (I) irregular small plates and amorphous granule cluster shapes of meglumine diatrizoate, (J) variable size rod shapes of tyrosine, (K) round margin irregular fern shapes of triple phosphate, (L) amorphous granules and barrel shapes of uric acid, (M) amorphous granule cluster shapes of uric acid sodium salt, (N) uric acid sodium salt exhibited rosetted plates and fine needles in 30% HCl, and (O) amorphous granule cluster shapes of xanthine.

Table 1 . Results of the crystal solubility test and birefringence

Crystals	30% AA	30% HCl	10% KOH	DW	60'C DW	Ethanol	Chloroform	Ether	Birefringence
Ca carbonate	+	+	-	-	-	-	-	-	Strong
Ca oxalate monohydrate	-	+	-	-	-	-	-	-	Strong
Ca phosphate dibasic	-	+	-	-	-	-	-	-	Negative
Ca sulfate	-	-	pl	-	pl	-	-	-	Strong
Cystine	-	+	+	-	-	-	-	-	Negative
Hippuric acid	-	-	+	-	-	-	-	-	Strong
Leucine	+*	+	+	+†	+	-	-	-	Strong
Triple phosphate	+	+	-	-	-	-	-	-	Strong
Meglumine diatrizoate	-	-	+	+	+	-	-	-	Negative
Tyrosine	-	+	+	-	-	-	-	-	Strong
Uric acid	-	-	+	-	-	-	-	-	Strong with polychromatism
Uric acid sodium salt	-	-	+	-	-	-	-	-	Strong with polychromatism
Xanthine	-	-	+	-	-	-	-	-	Weak

Abbreviations: AA, acetic acid; HCl, hydrochloric acid; KOH, potassium hydroxide; DW, distilled water; pl, partial lysis.

*5 minutes for lysis. ^†25 minutes for lysis.

CS, HA, CM, UASS 및 Xanthine 등 문헌에 보고된 용해도 결과가 부족한 5개 결정체는 용해도를 새로 확인했다. CS는 6가지 용액에서 완전히 용해되는 경우는 없었으나, 10% KOH와 60℃ 증류수에 부분 용해되었다. HA는 에탄올에서는 용액이 건조되면서 긴 육각형 막대 모양의 결정체가 생성되었고, 60℃ 증류수에서는 길이가 짧은 육각형 결정체가 관찰되었으며, 10% KOH에 용해되었다. CM은 10% KOH, 증류수 및 60℃ 증류수에 용해되었다. UASS는 용액의 pH에 따라 결정체 모양이 달랐다(Fig. 1M, N). 산성 용액에서는 바늘과 판 모양의 결정체 형태가 관찰되었으며, 그 외에는 무정형의 알갱이 덩어리로 관찰되었고, 10% KOH에 용해되었다. Xanthine은 모든 용액에서 무정형의 알갱이 덩어리로 관찰되었으며, 10% KOH에서만 용해되었다.

CS, HA 및 leucine 3개의 결정체는 문헌에 보고된 용해도 결과와 차이가 있었다(Table 2). CS는 30% AA에서 용해되지 않았으며, HA는 ether, hot water 및 에탄올에 용해되지 않았다. 반면, leucine은 30% HCl에 용해되었다. 한편, 에탄올, chloroform 및 diethyl ether에는 13개의 결정체 모두 용해되지 않았다.

Table 2 . Comparison of crystal solubility with literature data

Crystals	Solution	Literature	Our study	Reference
Ca sulfate	30% AA	+	-	[20]
Hippuric acid	Ether	+	-	[16,18]
	Hot DW	+	-	[16]
	Ethanol	+	-	[16]
Leucine	30% HCl	-	+	[15]

Abbreviations: AA, acetic acid; HCl, hydrochloric acid; DW, distilled water.

각 물질별 편광 강도는 Table 1과 Fig. 2에 요약하였다. CC, COM, CS, HA, leucine, TP, tyrosine, UA 및 UASS 등은 강한 편광 강도를 보였다. 또한 HA, Tyrosine, UA 및 UASS는 다염색성이 관찰되었다. Xanthine은 약한 편광 강도를 보였다. 그 외 CPD, cystine 및 CM은 편광을 보이지 않았다. UASS는 결정체의 모양에 따라 편광 강도가 변하였다(Fig. 2I–K).

Figure 2. The birefringence characteristics of ten crystals were obtained in ethanol (×200, ×400, ×900). Each crystal exhibited the following birefringence: (A) strong birefringence of calcium carbonate (×900). (B) strong birefringence of calcium oxalate monohydrate, (C) strong birefringence of calcium sulfate, (D) strong birefringence with weak polychromatism (white arrow) of hippuric acid, (E) strong birefringence of leucine, (F) strong birefringence of triple phosphate, (G) strong birefringence with variable polychromatism of tyrosine, (H) strong birefringence with polychromatism of uric acid, (I) moderate birefringence of uric acid sodium salt, (J) uric acid sodium salt in 30% hydrochloric acid (HCl) and 30% acetic acid (AA) exhibited strong birefringence, note that needle shape has no polychromatism (white arrow), (K) uric acid sodium salt in 30% HCl and 30% AA exhibited strong birefringence with polychromatism, and (L) weak birefringence of xanthine.

소변 결정체는 복잡한 물리화학적 과정으로 생성된다. 결정체 생성의 촉진자로 calcium, oxalate, urate 그리고 phosphate 이온이 대표적으로 알려져 있고, 억제제로는 citrate, magnesium 그리고 pyrophosphate가 알려져 있다. 추가로 거대분자인 nephrocalcin, glycosaminoglycans, Tamm-Horsfall/uromodulin 그리고 osteopontin 등도 있다[11]. Okada 등[12]은 osteopontin 존재 여부에 따라 결정체의 양과 모양에 현격한 차이가 있다고 보고하였다. 촉진자와 억제제의 균형이 깨지면 물질의 농도가 과포화 되면서 더 이상 녹아 있지 못하고 결정체가 만들어지기 시작하는데, 결정화, 결정체 성장과 응집, 결정체의 축적 등의 과정을 거친다. 이때 결정체가 만들어지는 위치와 기질과 같은 요소도 중요하다[11].

본 연구에서 관찰된 결정체들의 모양은 지금까지 문헌에 보고된 것과 일부 차이가 있었다[10]. 결정체의 모양의 차이는 결정체 생성 기전, pH, 요 비중 및 주입 경로, 물질의 상대적인 농도 등에 의해 발생되는 것으로 알려졌다. 결정체의 형성은 in vivo에서 이루어지므로, 순수한 물질과 다른 결정체 모양을 보일 수 있을 것으로 생각된다. Leucine은 방사상의 동심원 층판 구조를 가지는 타원형 결정체로 알려졌으나, Osborne 등[1]은 이 구조는 순수한 leucine이 아니기 때문이며 순수한 leucine은 육각형의 판 형태라고 보고하였다. 본 연구에서도 보고된 것과 동일한 육각형 판 형태의 결정체가 관찰되었다. 소변에서 관찰되는 결정체의 경우 순수한 물질이 아니며, 보고된 결정체들의 형태는 혼합물일 가능성이 높다.

같은 소변 결정체라도 pH에 따라서 모양이 다양하게 관찰될 수 있다. UA 결정체는 pH가 5.7보다 작을 때 관찰되며, 5.7보다 높은 경우 이온화되어 urate나 amorphous urate나 sodium urate와 같은 urate salt가 되어 결정체의 형태가 pH에 따라서 달라진다[13]. pH 의존도는 물질에 따라 다양하기 때문에 반드시 정해진 pH에서만 결정체가 관찰되는 것은 아니다[11]. 또한 산성 조건에서 관찰되는 결정체라고 하더라도 반드시 알칼리에 용해되는 것은 아니다. 비정상 결정체나 약물유발 결정체의 경우 대부분 산성뇨에서 관찰된다[14]. 산성에서 주로 관찰되는 결정체로는 calcium oxalate, UA, xanthine 등이 있고, 알칼리에서 관찰되는 결정체로 주로 amorphous phosphate, calcium phosphate, TP 등이 있다[13-17].

유전 및 대사장애 환자에서 주로 관찰되는 cystine은 광범위한 pH에서 관찰될 수 있으며, leucine과 tyrosine는 주로 산성에서 관찰된다[11,13]. 본 연구에서는 상기 3가지 물질 모두 30% HCl과 같은 강산과 10% KOH 같은 강염기에 용해되었다.

방사선 영상 조영제는 비이온성과 이온성 물질로 구분되는데, 이 중 이온성 물질만 결정체로 검출될 수 있다. Hypaque, renografin 및 cystografin 등으로 임상에서 사용되고 있으며, meglumine diatrizoate와 diatrizoate sodium의 화합물이다. 산성 pH에서 주로 관찰되고, 요 비중이 높을 때(>1.050) 바늘 모양으로 관찰될 수 있다. 이 조영제는 주입방법에 따라 결정체 모양이 달라지기도 하는데, 납작하고 긴 평행사변형의 판 모양 결정체가 관찰될 수 있으며, 강한 편광과 다염색성을 보인다[13,15].

Calcium oxalate는 calcium과 oxalate의 상대적인 농도에 따라 결정체의 모양과 크기가 변하기도 한다. Calcium의 농도가 높으면 타원이나 아령 모양이 더 흔하고, oxalate가 높으면 이중 각추(dipyramidal) 형태가 주로 관찰된다[18]. 이처럼 여러 가지 요소에 의해 결정체의 모양이 달라져 결정체 감별이 어려울 수 있다.

본 연구결과는 기존의 용해도 결과를 재확인하였고, 결과가 부족한 결정체의 용해도 결과를 확립하였다. 용해도 결과는 모양이 비슷한 결정체 감별에 유용하였다. CC와 COM은 문헌에 보고된 바로는 쌍을 이루는 구형이나 작은 과립형태로 결정체 모양이 비슷하게 관찰될 수 있는데, 이 경우 용해도 결과를 확인하면 감별이 가능하다[17]. CC는 30% AA에 용해되지만 COM은 용해되지 않고, CC는 30% AA와 30% HCl에서 기포가 발생하면서 용해되는 것이 두 결정체의 감별점이 된다. CC는 AA와 HCl과 반응하여 이산화탄소 기체를 생성하기 때문에 용해되면서 기포가 발생하며, 이는 검체 내 CC가 존재하는 것을 시사한다[19].

한편, CS, HA 및 leucine 3개의 결정체는 기존 문헌과 다른 용해도 결과를 보였다. CS는 문헌에서 1,000 mL의 물에 2.1 g이 용해된다고 알려졌으나, 본 연구에서는 용해되지 않았다[10]. 이는 충분한 양의 용액을 첨가하지 않아 발생한 것으로 생각된다. CS는 30% AA에 용해된다고 알려졌으나 본 연구에서는 용해되지 않아 추가로 100% AA로 실험하였으나 용해되지 않았다[20]. HA는 가열된 물과 에탄올에 용해되지 않아 반복 실험하였으나 동일한 결과를 보였다. HA의 경우 ether에 용해되는 것이 UA와의 감별점이나, 본 연구에서는 용해되지 않았다. 따라서 UA와 결정체 모양이 비슷한 경우에는 편광을 확인하여 감별해야 한다. HA와 UA 둘 다 강한 편광 강도를 보이나, UA는 다염색성이 두드러지게 관찰된다(Fig. 2D, H). Leucine은 문헌과 달리 30% HCl에 용해되었으며, 추가로 저 농도의 HCl에서도 용해되는 것을 확인했다.

Llinas 등[21]은 실제로 용해도를 정확하게 아는 것은 매우 어려우며, 문헌마다 차이가 있거나 결과가 부족한 경우가 많다고 보고하였다. 용해도는 같은 물질이라고 하더라도 다형성(polymorph) 때문에 달라질 수 있고, 정형적인 결정체 형태와 비정형적인 결정체 형태에 따라서도 크게 달라질 수 있다[21]. 소변에서 관찰되는 결정체는 체내에서 생성된 혼합물이기 때문에 용해도도 실험결과와 다소 차이가 있을 수 있다고 생각된다.

편광을 확인하면 결정체 간 감별뿐 아니라 다른 요침사와 감별하는 데 유용하다. 예를 들면 적혈구는 편광이 없으나 모양이 유사한 COM은 편광이 있어 감별이 가능하다[14]. 같은 물질이라고 하더라도 결정체의 모양에 따라 다양한 편광을 보일 수 있다[17]. 예를 들면 calcium phosphate는 결정체의 형태가 판 모양인 경우 편광을 보이지 않으나, 프리즘이나 별 모양인 경우에는 편광을 보인다[16]. UASS는 무정형의 알갱이나 침상 모양에는 다염색성이 관찰되지 않지만 판 모양은 다염색성이 관찰되었다(Fig. 2I–K).

본 연구는 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, 이 실험은 환자에서 검출된 결정체가 아닌 순수한 화학물질을 이용한 실험결과로 해석에 주의가 필요하다. 둘째, 소변 결정체가 체내에서 생성되는 과정을 고려하면 혼합물일 가능성이 높고, 소변 결정체는 혼합물의 구성 성분의 비율에 따라 결정체의 모양이 달라질 수 있다[11]. 또한 혼합물의 용해도는 각 구성 성분의 용해도와 혼합물 내에서의 상호작용에 따라 달라질 수 있다[19]. 본 연구에서는 혼합물의 용해도와 순물질의 용해도가 구체적으로 어떻게 다를지에 대한 평가는 하지 못했다.

본 연구는 문헌고찰에 의하면 소변 결정체 용해도 결과를 순수한 화학물질로 확인한 첫 연구로 간주된다. 13개의 순수한 물질의 결정체 모양과 용해도 결과를 확인했다. 그 중 5개의 물질에 대한 용해도 결과를 새로 정립하였고, 3가지 물질에 대한 용해도 결과가 문헌과 차이가 있는 것을 확인했다. 용해도 검사는 소변 결정체 감별에 유용하였으며, 편광을 추가하여 확인하면 임상 검체에서 관찰되는 주요한 결정체를 감별할 수 있다. 따라서 본 연구결과는 향후 결정체의 감별에 유용하게 활용될 것으로 생각된다.

이 논문은 대한진단검사정도관리협회 2023년 학술연구비 지원에 의해 이루어졌다(2023-13).