Acinetobacter baumannii는 중요한 원내 감염균으로 인공호흡기 연관 폐렴, 뇌수막염, 패혈증 및 요로감염을 일으킨다[1]. A. baumannii는 carbapenem 내성과 다른 여러 가지 항균제 계열에 내성을 보이는 다제내성(multidrug resistance)인 경우가 흔하여, 치료제의 제약이 심각한 실정이며, 이 경우 아직까지 감수성이 유지되고 있는 colistin과 tigecycline을 고려할 수 있다[2,3].

최근에는 tigecycline 내성 A. baumannii의 출현이 보고되고 있어, 이 균주에서 통상적인 tigecycline 감수성 시험의 필요성이 증가하고 있다[4], 하지만 최신 Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) guideline, M100-ED33 [5]이나 European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) [6]에서도 tigecycline에 대한 감수성 시험법은 제시되어 있지 않아 tigecycline 감수성 시험에 어려움이 있다. 통상적으로 검사실에서는 최신 미국 식약처(US Food and Drug Administration, FDA)에서 제안하는 장내세균 기준에 따라 tigecycline 감수성 시험을 시행하고 있지만[7], 이에 대한 적절성에 대한 평가는 부족한 실정이다

본 연구에서는 디스크확산법(disk diffusion test, DDT)과 최소억제농도법(minimal inhibitory concentration method, MIC)을 비교하여 A. baumannii의 tigecycline 감수성 시험에 문제점은 없는지 파악하고자 하였다.

1. 대상 균주

대상 균주는 Kor-GLASS (Korean Global Antimicrobial Resistance Surveillance System) 연구를 통해 전국 9개 종합병원에서 2022년 1년간 국내 9개 병원에서 수집한 혈액에서 분리된 A. baumannii 균주들 중 DDT로 tigecycline 내성을 보이는 44주를 대상으로 하였다. 균종 동정은 말디토프법(Bruker Biotyper; Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany)과 OXA-51 PCR (A. baumannii는 양성)으로 확인하였다.

2. Tigecycline 감수성 시험

DDT은 순수 배양 집락을 Muller Hinton agar에 접종하여 15 µg 농도의 tigecycline disk를 놓고 35±2℃에서 20–24시간 배양하였다. MIC method는 상품화된 Sensititre Gram Negative GN6F AST Plate (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 이용하여 1, 2, 4, 8 µg/mL의 tigecycline 농도로 제조사의 지시대로 시험하였다.

Acinetobacter spp.의 해석 기준은 2023년도 FDA-Identified Interpretive Criteria의 장내세균 기준에 따라 억제대가 14 mm 이하인 경우나 최소억제농도가 8 µg/mL 이상인 경우 내성으로 해석하였다[7].

3. 전장유전체 분석

DDT와 MIC method에 모두 tigecycline 내성인 균주는 항균제 내성 기전을 알아보기 위하여 전장유전체분석을 시행하였다[8]. 새로 계대 배양한 균주의 DNA를 GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 추출하여 NextSeq 550 Instrument (Illumina, San Diego, CA, USA)에 8 µg DNA를 투입하여 분석하였다. 얻어진 염기서열 데이터는 Spades ver. 3.11.1 (Center for Algorithmic Biotechnology, St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russia)로 조립(assembling)하고 Prokka ver. 1.13.7 (https://github.com/tseemann/prokka)로 주석(annotation)을 달았다. Center for Genomic Epidemiology 웹사이트를 이용하여 MLST ver. 2.0 (https://www.genomicepidemiology.org/)로 sequence type을 결정하였고[9], ResFinder ver. 4.0 (National Food Institute, Technical University of Denmark, Lyngby, Denmark)으로 내성 유전자 분석을 시행하였다. 본 연구는 국민건강보험 일산병원 의학연구윤리심의위원회의 승인을 받았다(2022-08-029).

DDT로 tigecycline에 위내성을 보인 44주 중 한 주만이 MIC method로도 내성을 보여, 두 방법의 일치율은 2.3% (1/44)였다. 내성인 균주는 DDT의 억제대가 11 mm였고, MIC는 8 µg/mL를 보였다(Table 1).

Table 1 . Comparison of the two antimicrobial susceptibility tests

Zone diameter (mm)	MIC (μg/mL)
11 (N=6)	2 (N=3), 4 (N=2), 8 (N=1)*
12 (N=18)	< 1 (N=1), 2 (N=13), 4 (N=4)
13 (N=13)	< 1 (N=1), 2 (N=9), 4 (N=3)
14 (N=7)	< 1 (N=3), 2 (N=4)

Abbreviation: MIC, minimal inhibitory concentration.

*Tigecycline resistance was confirmed.

Tigecycline 내성으로 확인된 한 주의 전장유전체를 분석한 결과 sequence type은 195였고 carbapenem에 내성 유전자인 bla_OXA23을 가졌으며, 다양한 항균제 계열에 대한 내성 유전자를 가지고 있었지만, tetracycline 계열의 내성 유전자는 획득은 발견되지 않았다(Table 2).

Table 2 . Resistance genes of phenotypic tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii (F22AB12)

Antimicrobial resistance	Resistance genes
Aminoglycoside	armA, aph(6)-Id, aph(3’’)-Ib
β-lactam	blaADC-25, blaOXA-23, blaOXA-66
Macrolide	msr(E), mph(E)
Sulfonamide	sul2

Acinetobacter baumannii는 중요한 원내 감염균으로 세계보건기구에서도 A. baumannii의 항균제 내성을 가장 심각하게 우려하고 있고, 새로운 치료약제의 개발을 최우선적으로 촉구하고 있는 실정이다[10]. Tigecycline은 glycylcycline 항균제로 리보좀의 30S subunit의 ribosomal A site에 부착하여 translation을 방해함으로써 broad-spectrum antimicrobial activity를 보인다[3]. 하지만 세균이 tigecycline의 작용기전을 억제하기 위한 전략을 개발하며 진화하고 있어, 최근에 tigecycline 내성 A. baumannii의 분리가 전 세계적으로 증가하고 있다[4].

Tigecycline의 내성 기전으로는 resistance-nodulation-division, AdeABC, AdeFGH, 및 AdeIJK 같은 항균제를 외부로 퍼내는 efflux pumps의 증가가 대표적이다[11]. 여기에는 transcriptional regulators인 AdeABC, AdeRS, AdeL, 및 AdeN가 관여하는 것으로 알려져 있다. 그 외에도 ribosome에서의 단백질 합성의 중요한 요소로 작용하는 ribosome recycling factor를 합성하는 rrf 유전자가 tigecycline 내성에 중요한 역할을 한다는 보고가 있다[12]. 최근에는 plasmid를 매개 tigecycline 내성이 보고되고 있는데, 이 경우 세균 간에 내성 유전자의 수평이동(horizontal transfer)가 가능하므로 용이하게 tigecycline 내성이 확산될 수 있으므로 더 심각한 문제가 아닐 수 없다. Plasmid 매개 tigecycline 내성 기전은 tetracycline 내성을 일으키는 tigecycline 내성 결정부위(tetX3, tetX4, tetX5 및 tetA)의 돌연변이다[13].

Tigecycline 내성 A. baumannii의 출현으로 이 균주에서 통상적인 tigecycline 항균제 감수성 시험의 필요성이 증가하고 있으나, CLSI guideline M100-ED33 [5]이나 EUCAST [6]에서 A. baumannii에 대한 tigecycline에 대한 감수성 시험법이 제시되고 있지 않은 실정이다. 따라서 많은 검사실에서는 미국 FDA 장내세균 기준에 따라 tigecycline 감수성 시험을 해석하고 있지만[7], 이에 대한 적절성에 대한 평가는 부족하다.

본 연구에서 미국 FDA의 장내세균 기준을 적용하여 DDT와 MIC method를 비교한 결과 A. baumannii의 tigecycline 내성 시험에서는 두 방법의 일치도가 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 정확한 tigecycline 내성 시험을 위해서는 항균제 감수성 시험법의 올바른 선택이 중요함을 확인할 수 있었다. 기존의 보고에서도 표준방법인 Mueller-Hinton (BH) broth를 이용한 MIC와 비교해 보았을 때 상품화된 Sensititre broth MIC법은 상관성이 좋았지만, E-test법이나 DDT의 경우 위내성이 증가하는 것을 알 수 있다[14]. 이 연구에 따르면 표준방법인 BH broth MIC법에서 대부분 감수성을 보인 균주들이 DDT로 실험한 결과, 중간 내성을 보인 균주는 50.5%–72.9%에 달하며, 내성인 경우도 2.8%–3.2%였다[14]. DDT의 위양성 가능성이 있고, Sensititre broth MIC법이 표준방법과 상관성이 높은 것을 근거로 본 연구에서는 Sensitire broth MIC법과 DDT에서 모두 내성인 경우만을 내성으로 간주하였다.

분리된 tigecycline 내성 A. baumannii는 한 균주였는데, tigecycline의 내성 기전의 하나인 tetracycline 내성 유전자는 확인되지 않았다. 이 균주의 내성 인자는 plasmid에 존재하는 내성 유전자에 의한 것보다는 기존에 알려진 active efflux pump에 의한 항균제의 외부 유출일 것으로 추측되나, 본 연구에서는 실험적으로 확인하지 못했다.

결론적으로, 정확한 tigecycline 감수성 시험을 위해서는 상품화된 broth MIC법인 Sensititre을 활용하는 것이 좋겠다.

본 연구는 국민건강보험 일산병원 연구비로 수행되었다(NHIMC 2021-20-001). KorGLASS 참여연구자 김영리(제주대학교병원 진단검사의학과), 김현수(한림대학교병원 진단검사의학과), 류남희(계명대학교병원 진단검사의학과), 신경섭(충북대학교병원 진단검사의학과), 신정환(인제대학교 부산백병원 진단검사의학과), 신종희(전남대학교병원 진단검사의학과), 어영(연세대학교 원주의과대학 진단검사의학과), 및 정석훈(연세대학교 의과대학 진단검사의학과)께 감사드린다(존칭 생략, 가나다 순).