세계보건기구(World Health Organization, WHO)는 2023년 5월에 코로나바이러스감염증-19 (coronavirus disease 2019, COVID-19)가 더 이상 국제적인 공중보건 비상사태가 아니라고 선언했다. 이는 사망률 감소와 입원환자 수의 감소, 그리고 개인 및 집단면역 수준의 상승으로 인한 결과이다[1]. 그러나 severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)의 변이로 인해 지속적인 모니터링이 필요한 상황에서[2], 인플루엔자가 동시 유행을 일으키며 사회경제적 비용의 증가를 가져왔다. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 B는 전 세계적으로 심각한 공중보건의 위협을 초래하여 높은 발병률과 사망률이 특징이다. 서로 증상이 유사한 COVID-19와 인플루엔자 감염을 명확히 구별하는 것은 어려운 것으로 알려져 있는데[3,4], 치료약물의 종류와 환자 관리법이 다른 이 둘을 정확히 감별하는 것은 중요한 일이다[5]. 이들 바이러스의 진단을 위해서는 분자진단법이 주로 사용되고 있는데, 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real-time reverse transcription PCR, rRT-PCR)은 바이러스의 특정 유전자 증폭을 통한 검출법이므로 높은 민감도와 특이도로 매우 정확한 진단을 내릴 수 있는 장점이 있으나[6], 유전자 추출 및 증폭에 필요한 기반시설이 필요하고, 고비용과 긴 측정시간이 단점이다[7]. 최근에는 대규모 고속 검출이 중요해지면서 신속항원검사(rapid antigen test, RAT)가 질병 전파를 통제하는 데 유용하게 사용된다. RAT의 장점은 빠르고(20–30분), 사용이 용이하며, 비용이 저렴하고, 전문 실험실이나 장비를 필요로 하지 않아 현장 진단에 사용할 수 있어 검사 적용에 있어 접근성이 좋다는 것이다[8,9]. 현재 시장에는 다양한 RAT가 있지만, 이러한 항원검사를 도입하기 전에 적절한 검증이 필요하다. 더욱이 SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 및 B를 동시에 검출할 수 있는 RAT의 개발은 자원 활용도, 환자 편의성, 진단 정확도 측면에서 상당한 이점을 제공한다[5]. 본 연구에서는 SARS-CoV-2와 인플루엔자 A/B 검사인 새로 개발된 RAT와 rRT-PCR 기반 분석을 비교 평가하고, 승인된 RAT 대조제품과의 유효성 평가를 진행하여 새로 개발된 RAT의 현장 검사에서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.

호흡기 감염이 의심되어 대전을지대학교병원 및 GC녹십자의료재단에서 호흡기 감염 관련 rRT-PCR을 시행하고 결과가 확인된 잔여 검체로, –70℃ 이하에서 보관된 비인두 도말 검체 총 436예를 사용하였고, 그 중 SARS-CoV-2 양성 88예, 인플루엔자 A형 양성 96예, 인플루엔자 B형 120예, SARS-CoV-2 및 인플루엔자 음성 검체 132예를 대상으로 평가하였다. SARS-CoV-2 양성 검체는 대전을지대학교병원에서 STANDARD M nCoV Real-Time Detection kit (SD Biosensor, Suwon, Korea)를 통해 SARS-CoV-2 양성으로 확진된 검체로 증상 발현 후 0–3일 이내 약 40%, 증상 발현 후 4–7일 이내 약 40%, 증상 발현 후 7일 이후 약 20% 검체의 비율에 가깝게 나누어 수집하였고, Ct값 ≤30인 검체, Ct값 >30인 검체, Ct값 ≤최소검출한계(limit of detection)인 검체에 대한 임상적 민감도 평가로 나누어 분석하였다. 또한 rRT-PCR 검사결과 Ct값 30 이상인 검체가 10% 이상이 되도록 하였다. 최소검출한계를 결정하기 위하여, 불활성화된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A와 B를 정상인의 비인두 도말 검체를 혼주하여 만든 음성 표준물질로 연속 희석하여 5단계 농도로 테스트하였다. 각 희석액은 5일간 20회 반복 시험하였으며, rRT-PCR을 이용하여 95% 이상 양성으로 판정되는 가장 낮은 농도(Ct값=26.06)를 확인하였다. 인플루엔자 A 및 B 양성 검체는 GC녹십자의료재단에서 인플루엔자 A 및 B 검사용으로 제공받은 검체로, 인플루엔자 확진법인 Allplex Respiratory panel 1 (Seegene, Seoul, Korea) 102예, Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay (Seegene) 10예 및 PowerChek SARS-CoV-2, Influenza A&B Multiplex Real-time PCR Kit (Kogene Biotech, Seoul, Korea) 8예를 통해 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B로 보고 완료된 검체였다. 음성 검체는 대전을지대학교병원에서 Allplex SARS-CoV-2/FluA/FluB/RSV Assay로 SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 및 B 모두 음성으로 확진된 검체를 대상으로 하였다. 연구 검체 수(n)는 식품의약품안전처 코로나19 체외진단의료기기 허가심사 가이드라인[10]과 고위험성 감염체 체외진단시약 성능평가 가이드라인[11]을 참고하여 산출하였다(Table 1). 임상적 진단성능평가를 위하여 rRT-PCR 결과를 기준으로 하여 새로 개발된 시험제품인 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag (Sugentech, Sejong, Korea)의 임상적 민감도, 임상적 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도를 확인하였고, SARS-CoV-2 검체 채취시기별, Ct값별 양성 민감도 평가를 진행하였다. 또한 대조제품과의 상관성 평가를 위하여 새 RAT와 기존 승인 제품된 제품인 SGTi-flex COVID-19 Ag (Sugentech) 및 SGT Influenza A&B (Sugentech)와의 일치도 평가를 진행하였다. 새로 개발된 RAT의 검사방법은 제품에 포함된 버퍼 100 μL와 바이러스 수송배지(viral transport medium) 검체 100 μL를 혼합하고 이 혼합물(1:1 비율)을 카세트의 검체 주입구에 3방울 떨어뜨린 다음 카세트를 판독기에 삽입하여 15분 후에 자동으로 양성/음성으로 판정한 결과를 확인하였다. RAT 카세트는 분석 전에 실온에서 15–30분 동안 보관되었다. 임상적 성능시험은 대전을지대학교병원 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)에서 승인받은 임상계획서에 따라 수행되었다(IRB no., EMC-2022-12-006).

Table 1 . Nasopharyngeal swabs confirmed as SARS-CoV-2 or Influenza A/B by rRT-PCR test

	No. of total samples	No. of valid samples	No. of excluded samples
SARS-CoV-2 positive	88	88	0
Influenza A positive	96	89	7
Influenza B positive	120	100	20
All negative	132	132	0
Total	436	409	27

Abbreviations: SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; rRT-PCR, real-time reverse transcription-polymerase chain reaction.

1. rRT-PCR 결과와 비교한 진단성능평가

1) 임상적 민감도 및 특이도

수집된 436개 검체의 결과를 취합 후, 성능과 무관한 사유로 무효의 결과가 나온 것으로 판단된 총 27개(27/436, 6.19%)의 검체(인플루엔자 A 양성 7개, 인플루엔자 B 양성 20개)를 탈락시켰고(Table 1), 나머지 409예의 검체를 활용하여 임상적 민감도, 임상적 특이도, 양성 예측도, 그리고 음성 예측도를 확인하였다(Table 2). rRT-PCR 결과를 비교하여 시험제품 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag의 임상적 성능평가를 진행하였을 때, 민감도와 특이도는 SARS-CoV-2는 90.91%와 100.00%, 인플루엔자 A는 97.75%와 100.00%, 인플루엔자 B는 93.00%와 100.00%로 확인되었다.

Table 2 . Clinical performance evaluation of the INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag test using rRT-PCR results (unit: %)

Performance	SARS-CoV-2	Influenza A	Influenza B
Sensitivity (95% CI)	90.91 (83.07–95.32)	97.75 (92.17–99.38)	93.00 (86.25–96.57)
Specificity (95% CI)	100.00 (98.86–100.00)	100.00 (98.81–100.00)	100.00 (98.81–100.00)
PPV (95% CI)	100.00 (95.42–100.00)	100.00 (95.77–100.00)	100.00 (96.03–100.00)
NPV (95% CI)	97.56 (95.40–98.73)	99.38 (97.76–99.83)	97.78 (95.58–98.90)

Abbreviations: COVID-19, coronavirus disease 2019; rRT-PCR, real-time reverse transcription-polymerase chain reaction; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; CI, confidence interval; PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value.

2) SARS-CoV-2 검체 채취시기별 임상적 민감도 평가

COVID-19의 양성 검체의 증상 발현일 이후 검체 채취시점 0–3일 이내, 4–7일 이내, 7일 이후로 구분하여 임상적 민감도를 확인하였다. 증상 발현일 이후 검체 채취시점이 3일 이내인 경우(채취시점 ≤3일) 97.14%의 매우 높은 임상적 민감도를 확인하였다. 증상 발현일 이후 검체 채취시점이 4–7일인 경우(4일≤ 채취시점 ≤7일) 100.00%로 매우 높은 임상적 민감도가 유지됨을 확인하였다. 증상 발현일 이후 7일 이내의 모든 검체의 민감도는 98.59%로 역시 높은 임상적 민감도를 보였다. 반면, 증상 발현일 이후 검체 채취시점이 7일 이후일 경우에는(채취시점 >7일), 58.82%의 임상적 민감도를 보여 rRT-PCR 결과보다는 검출률이 떨어지는 것으로 확인되었다(Table 3).

Table 3 . Clinical sensitivity of the INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag test after symptom onset using SARS-CoV-2 rRT-PCR positive results

Days after symptom onset	No. of positive samples	Positive	Negative	Sensitivity % (95% CI)
≤7	71	70	1	98.59 (92.44–99.75)
0–3	35	34	1	97.14 (85.47–99.49)
4–7	36	36	0	100.00 (90.36–100.00)
>7	17	10	7	58.82 (36.01–78.39)
Total	88	80	8	90.91 (83.07–95.32)

Abbreviations: COVID-19, coronavirus disease 2019; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; rRT-PCR, real-time reverse transcription-polymerase chain reaction; CI, confidence interval.

3) SARS-CoV-2 rRT-PCR 검사의 Ct값에 따른 임상적 민감도 평가

COVID-19의 양성 검체의 rRT-PCR의 Ct값 결과에 따라 임상적 민감도를 평가하였다. Ct값 25 이하의 경우 임상적 민감도는 100.00%로 매우 높게 나타났고, Ct값 25–30 사이 구간에서도 임상적 민감도는 90.91%로 매우 우수하였다. Ct값 30 이하 검체를 모두 합친 경우의 성능을 확인해보면 98.73%로 높은 임상적 민감도를 확인할 수 있었다. 한편, Ct값 30 초과 검체의 경우, 임상적 민감도 22.22%로 rRT-PCR 대비 낮은 검출률로 확인되었다. INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag의 분석적 민감도 최소검출한계 Ct값인 26.06 이하에서의 임상적 민감도 평가 시 100.00%의 결과를 확인하였다(Table 4).

Table 4 . Clinical sensitivity of the INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag test according to Ct values using SARS-CoV-2 rRT-PCR positive results

Ct value	No. of positive samples	Positive	Negative	Sensitivity % (95% CI)
Ct ≤30	79	78	1	98.73 (93.17–99.78)
Ct ≤25	68	68	0	100.00 (94.65–100.00)
25< Ct ≤30	11	10	1	90.91 (62.26–98.38)
Ct >30	9	2	7	22.22 (6.32–54.74)
Ct ≤26.06 (minimum detection limit)	71	71	0	100.00 (94.87–100.00)
Ct >26.06 (minimum detection limit)	17	9	8	52.94 (30.96–73.84)
Total	88	80	8	90.91 (83.07–95.32)

Abbreviations: COVID-19, coronavirus disease 2019; Ct, cycle threshold; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; rRT-PCR, real-time reverse transcription-polymerase chain reaction; CI, confidence interval.

2. 대조제품과의 상관성 평가

임상적 성능시험 방법에 기술된 절차와 방법에 따라 시험의료기기 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag와 기존 승인된 대조제품 SGTi-flex COVID-19 Ag 및 SGT Influenza A&B와의 일치도 평가를 진행한 결과, SARS-CoV-2는 전체 일치도 99.76%, Kappa (κ)=0.9922, 인플루엔자 A는 전체 일치도 99.76%, κ=0.9927, 인플루엔자 B는 전체 일치도 99.76%, κ=0.9930으로 SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 및 B 모두 대조제품과 비교하여 κ>0.8 이상을 기록하여, 일치도 평가기준에 따라 매우 좋음으로 확인하였다(Table 5).

Table 5 . Evaluation of concordance between reference products and the INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag test

	SARS-CoV-2 (SGTi-flex COVID-19 Ag)	Influenza A (SGT Influenza A&B)	Influenza B (SGT Influenza A&B)
INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag
Overall concordance % (95% CI)	99.76 (98.63–99.96)	99.76 (98.63–99.96)	99.76 (98.63–99.96)
Positive percent agreement % (95% CI)	100.00 (95.36–100.00)	100.00 (95.72–100.00)	100.00 (95.99–100.00)
Negative percent agreement % (95% CI)	99.70 (98.30–99.95)	99.69 (98.27–99.95)	99.68 (98.23–99.94)
Kappa value	0.9922	0.9927	0.9930

Abbreviations: COVID-19, coronavirus disease 2019; SARS-CoV-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2; CI, confidence interval.

전 세계적으로 COVID-19 정책이 완화됨에 따라, 이제 COVID-19 관리는 정상화 단계에 접어들었다. 그러나 SARS-CoV-2의 면역 회피능력이 이미 잘 알려져 있으며, 인플루엔자 또한 높은 변이 특성으로 인해 항원 변이를 지속적으로 일으켜 감염률이 증가하여 반복적인 유행을 초래하고 있다. 따라서 향후 몇 년간 COVID-19와 인플루엔자의 공동 유행은 불가피할 것이다[12]. 팬데믹 초기부터 SARS-CoV-2와 인플루엔자를 포함한 혼합 감염에 관한 여러 연구가 등장했고[13,14], 중국 칭다오 COVID-19 환자에서 가장 많이 검출된 호흡기 병원체는 A형 인플루엔자 바이러스(60.00%)와 B형 인플루엔자 바이러스(53.33%)였다[15]. COVID-19와 인플루엔자를 구별할 수 있는 RAT는 정확한 진단, 치료 및 관리를 위해 필수적이고, WHO도 질병에 더 신속하게 대응을 수 있도록 RAT의 사용을 권장하였다[16]. 본 연구에서 새롭게 개발한 뉴클레오캡시드 단백을 표적으로 하는 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag의 임상적 성능평가 결과, SARS-CoV-2의 경우, rRT-PCR 대비 Ct값 30 이상의 농도가 낮은 항원에 대한 양성검출률이 떨어지고, 발병기간에 따라 항원의 농도가 감소하므로 증상 발현일 7일 이후부터(채취시점 >7일)는 양성검출률이 떨어지는 경향은 있으나, 전체적인 결과를 확인하였을 때, SARS-CoV-2와 인플루엔자 A 및 B의 민감도는 각각 90.91%, 97.75%, 93.00%였으며, 특이도는 모두 100%로 이전의 연구들에 비해 높은 성능을 확인할 수 있었다[17,18]. 이는 WHO의 RAT 사용 시 민감도 80% 이상, 특이도 97% 이상을 충족시켜야 한다는 권고사항과[19], 식품의약품안전처의 코로나19 체외진단 의료기기 허가심사 가이드라인[10] 및 고위험성 감염체 체외진단시약 성능평가 가이드라인 기준[11]인 민감도 80% 이상(신뢰구간 하한치 70% 이상), 특이도 95%(신뢰구간 하한치 90% 이상)을 모두 만족시키는 결과이다. 또한 대조제품으로 쓰인 SGTi-flex COVID-19 Ag의 민감도와 특이도는 89.00%와 100.00%이고, SGT Influenza A&B는 88.27%와 100.00%로 기존 검사보다 새 RAT가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

탈락한 검체는 2회 시험한 결과가 모두 무효(invalid)인 경우(결과창에 대조선 C가 나타나지 않은 경우)로, 시험 제품 및 2종의 대조제품에서 동일한 결과를 확인하였다. 해당 검체는 추가적으로 rRT-PCR 분석을 통해 검체의 결과를 확인하였다. 27개 검체 중 24개는 확진 결과와 동일한 바이러스를 검출하였으나, 3개 검체는 확진 바이러스와 함께 타 바이러스의 동시 감염의 결과를 보였다. 하지만 확진된 인플루엔자 바이러스 역시 동일하게 검출되었고, 확진 시의 Ct값과 큰 차이가 없는 것으로 보아, 확진 시 rRT-PCR이 인플루엔자 A, B만 검출 가능한 제품이었기 때문에 차이를 보인 것으로 검체의 오염이나 변질의 문제로 보이지는 않았다. rRT-PCR의 결과에 큰 문제는 없으면서, 시험제품 및 대조제품인 신속항원제품에서만 모두 무효의 결과가 나온 점, 탈락한 검체의 성상이 나머지 검체와 다르게 끈적이는 부분이 확인된 점을 바탕으로 핵산전용 수송배지에 보관된 검체로, 신속항원제품에 적용 불가능한 검체였던 것으로 추정된다. 따라서 성능과 무관한 사유로 무효의 결과가 나온 것으로 판단되어 탈락 처리하였다.

현재 주된 COVID-19 및 인플루엔자 A/B 진단방법인 분자진단법(rRT-PCR)은 높은 민감도와 특이도가 장점이지만, 검체 전처리 및 검사 시 특정 장비와 시설이 갖춰진 장소와 전문인력이 요구되며 결과 분석까지 많은 시간이 소요된다. 따라서 현장에서 진단하여 빠르게 대응 가능한 RAT 제품의 필요성은 높아졌다[20]. RAT의 전제조건은 검출의 민감도와 정확도를 보장하는 것이다. 본 연구에서는 15분 이내에 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 B를 동시에 검출할 수 있는 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag의 임상적 유효성을 평가하였다. 그 결과 다양한 성능지표(민감도, 특이도, 최소검출한계, 일치도)는 높은 수준으로 확인되었다. 따라서 INCLIX TRF COVID-19 & Flu A/B Ag은 병원 외래나 응급실 등에서 SARS-CoV-2 팬데믹과 계절성 인플루엔자에 대응하는 데 유용하며, 호흡기 전염성 질환에 대한 초기 및 신속한 진단을 통해 질병 확산을 통제하고 적절한 격리 및 치료전략을 결정하는 데에 도움이 될 것으로 생각된다.

본 연구는 정부(과학기술정보통신부, 산업통상자원부, 보건복지부, 식품의약품안전처)의 재원으로 범부처전주기의료기기연구개발사업단의 지원을 받아 수행된 연구이다(과제고유번호: RS-2020-KD000021).