아포지단백 E (apolipoprotein E, APOE)는 지질의 대사와 이송에 중요한 역할을 하는 34 kD 크기의 당단백질이다[1]. APOE 유전형은 알츠하이머병과 심혈관질환의 위험도를 예측하는 데 중요한 분자 표지자이다[2]. APOE 유전자의 여러 유전형 표적이 보고되고 있으나, 두 개의 과오 변이(코돈 112의 rs429358 및 코돈 158의 rs7412)가 가장 중요하다[3,4]. 이 두 개 변이의 조합으로 세 개의 대립유전자(E2, E3 및 E4)와 여섯 개의 유전형(E2/E2, E3/E3, E4/E4, E2/E3, E2/E4, 및 E3/E4)이 발생한다[5].

APOE 유전형 검사를 위한 DNA을 기반으로 한 기법에는 염기서열분석법[6], polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) [7], single-strand conformation polymorphism [8], allele-specific PCR [9,10], fluorescence resonance energy transfer-based melting curve analysis [11], real-time Taqman PCR [12], real-time SYBR Green PCR [13], high-resolution melting curve analysis [14], denaturing high-performance liquid chromatography [15], SNaP-shot mini-sequencing [16], MALDI-TOP mass spectrometry [17], PCR-GoldMag lateral flow assay [18] 등이 보고되었다. PCR-RFLP 기법을 이용한 APOE 유전형 검사는 1990년 Hixson과 Vernier [7]에 의해 개발된 오래된 기법이나, PCR-RFLP 기법의 장점[19]으로 인해 여전히 이용되고 있다[20]. 하지만 HhaI 제한효소를 이용한 PCR-RFLP 기법에서는 100 bp 이하의 작은 크기의 표적 밴드를 구분할 수 있어야 하는데, 범용 아가로스의 낮은 해상도로 인해 일반적인 아가로스 전기영동으로는 구분할 수 없으므로 polyacrylamide 겔 또는 MetaPhor 아가로스 겔(Lonza, Rockland, ME, USA)과 같은 고해상도 겔을 이용해야 한다[7,21].

최근 고전압으로 전기영동으로 하여 고해상도로 작은 크기의 DNA 절편을 구분할 수 있는 lithium borate buffer (LBB)가 소개되었다[22]. 본 연구에서 LBB와 범용 아가로스 겔을 이용한 고해상도 아가로스 겔 전기영동으로 APOE 유전형 검사를 위한 PCR-RFLP 기법을 개발하고자 하였다.

1. 검체 및 DNA 추출

2021년 1월부터 2021년 11월까지 수집된 103개의 K₂EDTA 처리된 혈액 검체에서 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 회사 지침에 따라 DNA를 추출하였다.

2. PCR 및 제한효소 처리

PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara, Shiga, Japan) 10 μL, DNA 1 μL, 전방(5’-GGCACGGC TGTCCAAGGA-3’) 및 후방(5’-CTCGCGGATGGCGCTGAG-3’) 시발체[23] 각 0.5 μM 및 증류수를 첨가하여 총 20 μL가 되도록 하였다. Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 다음 조건으로 PCR을 진행하였다. 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 15초, 68℃ 30초, 72℃ 30초씩 45회 증폭하였다. 정제하지 않은 PCR 산물에 HhaI (NEB, Ipswich, MA, USA) 1 μL을 첨가하고 37℃에서 3시간 처리하였다. PCR 산물 내 HhaI 제한효소 인식부위의 개수는 rs429358 변이와 rs7412 변이에 따라 다양하여 E2 대립형질은 91 bp와 83 bp의 특이적인 절편이 관찰되고, E3 대립형질은 91 bp와 48 bp 및 35 bp의 특이적인 절편이 관찰되며, E4 대립형질은 72 bp와 19 bp 그리고 48 bp와 35 bp의 특이적인 절편이 관찰된다. 위 대립형질별 절편 길이 다형성을 이용하여 APOE 유전형을 판정하였다(Fig. 1).

Figure 1. APOE genotyping by polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism using high-voltage agarose gel electrophoresis with lithium borate buffer at 300 V for 50 minutes. Abbreviations: M, 20 bp DNA Ladder (Takara, Shiga, Japan); UD, undigested PCR product.

3. Lithium borate buffer 및 3.5% 아가로스 겔 제조

붕소리튬산화물(lithium tetraborate, anhydrous; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 3.38 g을 증류수 800 mL에 녹이고 1 L가 되도록 증류수를 첨가하여 20× (20 mM) LBB를 만들었다. 이 용액의 pH를 조정하지 않았으며 1× (1 mM) LBB는 4℃ 냉장보관을 하였다[22]. 3.5% 아가로스 겔을 만들기 위해 범용 아가로스인 SeaKem LE Agarose (Lonza, Rockland, ME, USA) 3.5 g을 1× LBB 100 mL에 넣고 전자레인지를 이용하여 녹인 후 60℃로 실온에서 식히고, 10 mg/mL 농도의 ethidium bromide (EtBr; Sigma-Aldrich) 10 μL를 넣고 잘 섞었다. 이 아가로스 용액을 mini-gel tray (109 mm×60 mm; Takara)에 분주하고 17-well comb (Takara)를 각각 꽂았다. 겔을 굳힌 후 4℃ 냉장보관을 하였다.

4. 전기영동

전극간 길이가 20 cm인 전기영동 챔버(Solgent, Daejeon, Korea)와 Elite 300 (Wealtec, Taipei, Taiwan) 전원공급장치 그리고 전기영동 버퍼로 1× LBB를 이용하였다. 제한효소 처리된 PCR 산물 10 μL를 아가로스 겔 각 well에 분주하고 300 V 전압을 걸어 전기영동을 하였다. 전기영동이 완료된 후 양극(anode) 챔버의 버퍼온도를 측정하였다. DNA 분자량 마커로 20 bp DNA Ladder (Takara)를 이용하였다.

5. DNA 염기서열분석

PCR-RFLP 결과를 확인하기 위하여 염기서열분석을 실시하였다. PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara) 10 μL, DNA 2 μL, 전방(5’-ACTGACCCCGGT GGCGGAGGA-3’) 및 후방(5’-CAGGCGTATCTGCTGGGCCTGCTC-3’) 시발체[10] 각 0.5 μM 및 증류수를 첨가하여 총 20 μL가 되도록 하였다. Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 다음 조건으로 PCR을 진행하였다. 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 15초, 65℃ 30초, 72℃ 30초씩 35회 증폭하였다. ExoSAP-IT PCR Product Cleanup Reagent (Thermo Fisher Scientific)로 정제 후 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific)와 ABI 3730XL (Thermo Fisher Scientific)으로 상기 각 PCR 시발체를 이용하여 분석하였다. rs429358 변이와 rs7412 변이를 종합하여 E2/E2는 T/T, E3/E3는 T/C, E4/E4는 C/C, E2/E3는 T/Y, E2/E4는 Y/Y, E3/E4형은 Y/C를 해석 기준으로 삼아 APOE 유전형을 결정하였다.

6. PCR-RFLP와 염기서열분석법 결과 비교

PCR-RFLP 결과와 염기서열분석 결과를 비교평가하기 위해 일치율, 정확도 및 정밀도를 이용하였다.

1. 전기영동 시간 및 밴드 변형

300 V로 전기영동을 하였을 때 표적 DNA 밴드 중 91 bp와 83 bp를 비교적 쉽게 구분할 수 있는 전기영동 시간은 50분이었으며, 해석에 영향을 미치지 않는 약한 밴드 변형이 관찰되었다(Fig. 1).

2. 버퍼온도 변화와 겔 변형

300 V로 50분 동안 전기영동한 후 양극 버퍼의 온도는 18℃였다. 전기영동 시작 전 버퍼의 온도는 4℃였으므로, 양극 버퍼온도 변화는 14℃였다. 또한 상기 전기영동 조건에서 아가로스 겔의 변형은 관찰되지 않았다.

3. PCR-RFLP와 염기서열분석법 결과 비교

PCR-RFLP 결과와 염기서열분석 결과의 일치율, 정확도 및 정밀도는 각각 100%, 100% 및 100%였다(Table 1).

Table 1 . Results of PCR-RFLP and sequencing for APOE genotyping.

Genotypes	No. of PCR-RFLP (%)	No. of sequencing (%)	Concordance %
E2/E2	1 (0.97)	1 (0.97)	100
E2/E3	8 (7.77)	8 (7.77)	100
E2/E4	1 (0.97)	1 (0.97)	100
E3/E3	78 (75.73)	78 (75.73)	100
E3/E4	14 (13.59)	14 (13.59)	100
E4/E4	1 (0.97)	1 (0.97)	100
Total	103 (100.00)	103 (100.00)

Abbreviation: PCR-RFLP, polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism.

겔 전기영동은 PCR-RFLP의 필수적인 과정이다. 그러나 표적 DNA 절편을 구분하기 위해서 적절한 겔 성분, 겔 농도 및 전기영동 버퍼를 이용해야 한다[24]. HhaI 제한효소를 이용한 APOE 유전형 검사에서는 작은 크기(91 bp, 83 bp, 72 bp, 48 bp, 35 bp 및 30 bp)의 표적 밴드를 구분해야 하므로 높은 농도의 특별한 겔 유형(8% polyacrylamide 겔 또는 4% MetaPhor 아가로스 겔)을 이용해 왔다[7,21]. 일반적인 범용 아가로스 겔의 해상도 범위는 100 bp–23 kb로, 100 bp 이하 작은 DNA 절편을 구분하기는 어렵다. Polyacrylamide 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)은 높은 해상도를 가져서 HhaI을 이용한 APOE 유전형 검사에 적합하나, acrylamide가 신경독성을 일으키고 polyacrylamide 겔을 제조하는 데 불편한 단점이 있다[19]. 이 단점을 극복하고자 MetaPhor 아가로스 겔 전기영동(MetaPhor agarose gel electrophoresis, MAGE)이 개발되어 이용되고 있다[21]. MetaPhor 아가로스 겔은 20–800 bp 크기의 작은 DNA 절편을 2% 차이를 구분할 수 있을 정도로 고해상도 겔이다[25]. 하지만 MetaPhor 아가로스는 본 연구에 이용한 범용 아가로스인 SeaKem LE 아가로스보다 약 6배 정도 더 비싼 단점이 있다.

APOE 유전형 검사를 위한 PCR-RFLP에서 PAGE와 MAGE 모두 Tris-borate-ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA) (TBE) 버퍼를 이용한다. TBE 버퍼는 Tris-acetate-EDTA (TAE) 버퍼와 함께 가장 널리 쓰이는 버퍼이며, TAE 버퍼보다 작은 DNA 절편을 구분하는 데 더 유리하다[19]. 일반적으로 TBE 버퍼를 이용한 전기영동에서 약 5–10 V/cm 전기장 세기를 이용하여 전기영동을 실시하는데 10 V/cm을 초과하는 전압을 걸면 버퍼의 온도가 상승하고 밴드의 모양이 변형되며, 겔이 녹을 수도 있다[24]. 본 연구에 이용한 LBB는 낮은 몰농도(molarity)를 가지는 전도 매질(conductive media)이다. LBB와 TBE의 차이는 TBE의 Tris 양이온 대신 리튬이온인 것과 리튬이온의 농도가 Tris 이온 농도보다 낮으며, EDTA가 없다는 것이다. 리튬은 알칼리 금속류 중 상대적으로 더 큰 수화 껍질(shell of hydration)을 가진다. 따라서 알칼리 금속류 중에서 가장 낮은 전류를 발생시킨다. 그리고 TBE의 Tris 양이온의 농도는 40–90 mM 정도인데 비해 LBB의 리튬 농도는 1 mM이다[22]. EDTA를 첨가하는 이유는 DNA 핵산분해효소를 억제하여 DNA를 보존하는 것인데, 핵산분해효소에 오염되지 않은 버퍼라면 EDTA를 꼭 넣어야 하는 것은 아니다[24]. 버퍼에 EDTA를 넣으면 전도도에 영향을 끼쳐 DNA 절편의 이동 속도가 느려질 수 있다[22]. 이와 같은 리튬의 전기적 특성과 낮은 리튬 농도 그리고 EDTA를 사용하지 않음으로 인해 LBB에 고전압을 걸어도 온도의 상승을 억제할 수 있다[22]. 본 연구에서 15 V/cm을 50분 동안 적용한 후 14℃ 정도의 온도 상승이 있었으며 약한 밴드 변형이 관찰되었으나 해석에 영향을 미치지 않았다. 또한 아가로스 겔의 변형은 관찰되지 않았다.

EtBr은 DNA 절편을 염색하는 데 널리 이용되고 있다. EtBr은 양이온이므로, DNA와 반대 방향으로 이동한다[26]. EtBr과 결합한 DNA는 양극으로 이동속도가 느려진다[26]. 본 연구에서 전기영동 전에 겔을 EtBr로 염색을 하였는데, 충분히 빠른 전기영동 속도와 높은 해상도를 보였다. 이를 통해 30분 정도의 전기영동 후 염색과정을 실시하지 않을 수 있었다.

본 연구에 이용한 SeaKem LE 아가로스는 범용 아가로스로서 회사 지침에 따르면 100 bp–23 kb 정도의 해상도, 높은 겔 강도(>1,200 g/cm²), 낮은 전기삼투(electroendosmosis)와 높은 용융온도(>90°C)를 가진다. 범용 아가로스와 함께 LBB를 이용하여 LBB의 우수한 장점을 그대로 가지면서 고전압을 걸 수 있으므로 용이한 아가로스 겔 제작, 빠른 전기영동 속도와 고해상도의 결과를 얻을 수 있었다. 또한 20× LBB 1 L 가격은 약 3,500원 정도로 68,000원인 10× TBE 버퍼(Thermo Scientific) 1 L보다 저렴하고 SeaKem LE의 가격도 MetaPhor보다 저렴한 장점이 있다.

본 연구의 제한점으로는 첫째, 다양한 전기영동 장비에 대한 평가를 하지 않았다는 것이다. 따라서 검사실 또는 연구실에서 본 기법을 적용할 때는 가지고 있는 전기영동 장비로 평가한 후 검사 또는 연구에 적용해야 할 것이다. 둘째, DNA 염색을 위해 EtBr를 사용하였는데, EtBr은 발암물질이므로 취급에 주의를 해야 한다. 따라서 최근에는 EtBr를 대신할 수 있는 안전한 DNA 염색시약이 시판되고 있다[26]. 하지만 이러한 염색시약에 대한 평가를 하지 않아 초고속 전기영동에 적합한지 알 수 없다. EtBr 대신 다른 염색시약을 사용하고자 하는 검사실 또는 연구실에서는 평가 후 사용해야 할 것이다. 셋째, PCR-RFLP 기법은 여러 단계를 거쳐야 하므로 검사시간이 상대적으로 길고 노동집약적인 단점이 있다[14,19].

최근 APOE 유전형 검사를 위한 real-time PCR 기법이 널리 이용되고 있다[11-14]. Real-time PCR 기법은 PCR 후 검체 처리를 위해 PCR 튜브 뚜껑을 열 필요가 없어 신속하며 대용량 검사에 적합하다[14,27]. 그러나 LBB와 범용 아가로스를 이용하여 APOE 유전형 검사를 실시하면 검사 세팅과정이 단순하고 비싼 장비가 필요 없으며 검사시약이 비교적 저렴하므로 real-time PCR 장비가 없거나 APOE 유전자 검사량이 적은 검사실의 경우 비싼 real-tiem PCR 장비와 고가의 시약이 필요한 real-time PCR 기법보다 본 검사기법이 더 유리할 것으로 생각된다.

결론으로, 본 연구에서 LBB와 범용 아가로스를 이용한 고전압 및 고해상도 전기영동을 실시하여 HhaI 제한효소를 이용한 APOE 유전형 검사를 성공적으로 실시할 수 있었다. 또한 작은 DNA 절편을 고해상도로 구분하기 위해 사용되는 polyacrylamide 겔 또는 MetaPhor 아가로스 겔을 LBB와 범용 아가로스 겔로 대체할 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 조선대학교 연구비(2015)를 받아 수행되었다.