레베티라세탐(levetiracetam)과 라모트리진(lamotrigine)은 각각 뇌전증, 뇌전증 또는 양극성 장애 환자 치료에 사용되는 약물이다[1-3]. 혈청 레베티라세탐 및 라모트리진의 신뢰할 수 있는 정량화는 뇌전증 및 양극성 장애 환자의 치료약물농도감시(therapeutic drug monitoring)를 시행하는 데 필수적이다. 이에 저자들은 혈청 검체에서 레베티라세탐 및 라모트리진을 정량화하기 위한 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UHPLC-MS/MS) 검사법을 구현하고 검증했다[1-3].

10 μM 레베티라세탐-²H₃ (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 10 μM 라모트리진 ¹³C₃, d3 (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada)을 내부표준물질(internal standards)로 분석하여 UHPLC-MS/MS 검사법을 개발했다. 검체 전처리에는 메탄올(methanol)을 이용한 제단백, 0.1% 포름산(formic acid) 수용액을 이용한 희석이 포함되었으며, 준비된 검체를 multiple reaction monitoring, electrospray ionization positive 모드에서 UHPLC-MS/MS Triple Quad 4500MD (SCIEX, Singapore)를 이용하여 검사하였다. 이동상 A인 0.1% 포름산 수용액과 이동상 B인 100% 아세토니트릴(acetonitrile)을 이용하여 유량 0.40 mL/min로 Kinetex (2.6 μm C18 100 Å, 100 mm×3.0 mm; Phenomenex, Torrance, CA, USA) 컬럼이 장착된 ExionLC AD (Sciex, Framingham, MA, USA) UHPLC 장비를 사용하였다. 질량 분석기는 전구체(precursor)에서 생성물 이온(product ions)으로의 전이(transition)를 통해 구동되었다. 레베티라세탐, 레베티라세탐-내부표준물질, 라모트리진 및 라모트리진-내부표준물질 각각의 mass-to-charge ratio (m/z)는 다음과 같다(m/z: 171.0→126.0, 177.1→132.1, 256.0→210.9, 262.1→216.8) 레베티라세탐, 라모트리진의 전체 분석시간은 7분이었다.

분석장비 조건은 Table 1 (UHPLC 조건), Table 2 (MS/MS 조건)에 제시한 바와 같다. 본 연구에서는 검사법을 평가하기 위해 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에 제시된 평가지침 및 문헌에 따라 UHPLC-MS/MS법을 이용하여 측정한 혈청 레베티라세탐 및 라모트리진 농도에 대하여 정밀도, 직선성, 회수율 및 잔효, 이온화 억제 및 향상을 평가하였다[4-14].

Table 1 . Analytical instrument conditions for ultra-high performance liquid chromatography.

Variable	Values/features
Mobile phase A	0.1% formic acid in water
Mobile phase B	100% acetonitrile
Gradient
0.01 min	A (85%), B (15%)
1.00 min	A (85%), B (15%)
3.50 min	A (30%), B (70%)
3.60 min	A (10%), B (90%)
4.50 min	A (10%), B (90%)
4.60 min	A (85%), B (15%)
7.00 min	A (85%), B (15%)
Washing solvent	50% MeOH
Autosampler temperature	10℃
Injection volume	5 μL
Run time	7 min
Flow rate	0.4 mL/min

Table 2 . Analytical instrument conditions for tandem mass spectrometry (multiple reaction monitoring condition).

Compound	Q1 (precursor ion, m/z)	Q3 (product ion, m/z)	Dwell time (ms)	Declustering potential (V)	Entrance potential (V)	Collision energy (V)	Collision cell exit potential (V)
Levetiracetam	171.0	126.0	80	46	10	21	10
Levetiracetam-IS	177.1	132.1	80	41	10	21	8
Lamotrigine	256.0	210.9	80	111	10	37	14
Lamotrigine-IS	262.1	216.8	80	45	9	39	7

Abbreviations: m/z, mass-to-charge ratio; IS, internal standard..

각각의 평가에 대한 통계는 Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

정밀도는 MassCheck Antipileptic Drugs Plasma Control 시료(Chromsystems, Gräfelfing, Germany)인 세 가지 각각 다른 농도의 시료를 이용하여 1일 1회(1일 내 5회), 5일 동안 반복 측정하여 평가하였다[4,5].

직선성은 CLSI EP06-ED2에 따라 평가하였다[7]. 레베티라세탐 및 라모트리진 표준품(Sigma Aldrich)을 증류수로 계단 희석 후 drug free serum으로 희석하여 직선성을 확인할 수 있는 농도의 물질을 조제하였다. 이들을 각각 5회씩 반복 측정하여 그 결과를 이용하여 직선성을 평가하였다.

회수율은 레베티라세탐 및 라모트리진 표준품을 증류수로 계단 희석 후 drug free serum으로 희석하여 회수율을 확인할 수 있는 농도의 물질을 조제하였다. 이들을 각각 5회씩 반복 측정하여 그 결과를 이용하여 회수율을 평가하였다[8].

잔효는 [L1–(L3+L4)/2]/[(H2+H3)/2–(L3+L4)/2]×100 계산식으로 구하여 평가하였고 평가기준은 <±1.0%로 설정하였다[9-11].

이온화 억제 및 향상은 500 ng/mL의 레베티라세탐, 1,000 ng/mL 라모트리진 혼합표준 용액을 제조하여 주입 펌프를 이용하여 지속적으로 주입한 상태에서, 동일하게 전처리한 증류수와 6개의 독립적 시료를 UHPLC의 auto-sampler를 이용하여 주입하였을 때, 피크가 검출되는 머무름 시간에 이온화 억제 또는 향상 현상이 발생하는지 여부를 판단하여 평가하였다[12-14].

각 종목별 정밀도 평가결과를 Table 3에 제시하였다. 각 종목별 정밀도 평가결과, 총 변이계수는 2.86%에서 6.21% 수준의 값을 보였다[6]. Fig. 1은 레베티라세탐 및 라모트리진 검사항목의 직선성 평가결과를 보여주는 그래프이다. 직선성 평가에서 두 종목 모두 결정계수가 0.99 이상이었다. 각 종목별 회수율 평가결과를 Table 4에 제시하였다. 각 종목별 회수율 평가결과, 회수율은 96.00%에서 105.53% 수준의 값을 보였다[6]. 레베티라세탐 및 라모트리진의 잔효는 각각 0.022%, 0.030%로 평가기준을 만족하였다. 레베티라세탐, 라모트리진 모두 머무름 시간에 시료의 기질에 의한 억제 및 향상 현상이 발견되지 않아 평가기준을 만족하였다.

Table 3 . Precision of levetiracetam and lamotrigine measurements using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Items	Level	Mean±SD (μg/mL)	CV (%)
Levetiracetam	Low	8.77±0.35	3.94
	Medium	17.45±0.55	3.14
	High	72.12±2.06	2.86
Lamotrigine	Low	1.61±0.10	6.21
	Medium	3.21±0.19	5.83
	High	13.05±0.58	4.46

Abbreviations: SD, standard deviation; CV, coefficient of variation..

Table 4 . Recovery of levetiracetam and lamotrigine measurements using ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

Items	Assigned (μg/mL)	Mean±SD (μg/mL)	CV (%)	Recovery (%)
Levetiracetam	0.60	0.60±0.01	1.91	99.33
	1.20	1.21±0.02	1.50	101.17
	4.80	4.80±0.06	1.24	100.00
	24.00	25.33±0.38	1.49	105.53
	96.00	96.74±1.57	1.62	100.77
	120.00	121.74±2.98	2.45	101.45
	230.00	224.41±5.37	2.39	97.57
	340.00	340.13±6.68	1.96	100.04
Lamotrigine	0.175	0.17±0.01	7.76	96.00
	0.35	0.36±0.02	6.32	104.00
	1.40	1.38±0.09	6.35	98.29
	7.00	7.26±0.16	2.23	103.77
	28.00	28.50±0.57	2.01	101.79
	35.00	34.13±0.18	0.54	97.53
	67.50	64.99±1.76	2.71	96.28
	100.00	99.98±3.29	3.30	99.98

Abbreviations: SD, standard deviation; CV, coefficient of variation..

Figure 1. Linearity analyses by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method measurements. (A) Levetiracetam. (B) Lamotrigine.

UHPLC-MS/MS법을 이용한 혈청 레베티라세탐 및 라모트리진의 농도 측정은 정밀도, 직선성, 회수율, 잔효, 이온화 억제 및 향상에 있어서 매우 만족할 만한 결과를 보였다. 따라서 혈청 레베티라세탐 및 라모트리진 UHPLC-MS/MS 검사법은 연구목적뿐 아니라 임상검사 목적으로도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 생각된다.