1900년대 초기에 개발된 Romanowsky effect를 이용한 Leishman, Giemsa, May-Grunwald-Giemsa, Wright, Wright-Giemsa 등의 염색법은 지금까지 말초혈액, 골수흡인세포검사, 체액세포검사 등 세포 형태학적 진단에 꾸준히 사용되고 있다[1,2]. 이렇게 오래전부터 정착되고 안정화된 염색법을 사용하여 검사를 수행하고는 있지만, 검사장비의 문제, 시약의 변성, 검사자의 실수, 부적절한 온도 및 습도 등의 영향으로 염색상의 변화가 있을 가능성은 언제나 존재한다.

염색법에 대한 정도관리의 객관적인 지표를 발굴함은 최상의 염색을 유지하는 근거로 삼을 수 있고, 예기치 못한 오류로 인해 발생할 수 있는 부적합 염색상을 조기에 발견하고 교정하는 데 도움을 줄 수 있다. 또한 이전까지는 할 수 없었던 서로 다른 기관 간 염색법의 비교평가에 활용하여 염색법의 질 향상에도 도움이 될 수 있다.

최근 몇 년간 디지털 이미지 분석의 중요성이 증가하고 인공지능과 함께 세포와 조직의 형태학적 검사에 여러 가지 용도로 활용되며 적용되고 있다[3-8]. 하지만 부적합한 염색법을 사용한 검체의 경우에는 세포 인식률이 떨어져 세포의 분류가 실제와는 다르게 적용될 수 있다.

본 연구에서는 염색법의 정도관리를 위해 디지털 세포 이미지 분석기를 이용한 질 관리지표를 발굴하고 활용해 보고자 한다.

1. 연구대상자

본 연구는 삼성창원병원의 연구심의위원회 승인을 받았다(SCMC 2022-01-015). 삼성창원병원의 건강검진센터에서 정규 일반혈액검사(complete blood count with differential count, DIFF_CELL)가 의뢰된 검체를 대상으로 일반혈액검사의 결과값이 모두 참고치 이내이며 30세 이상인 200명의 “대상군”을 30일 동안 선정하였다. 대상군 선정기준과 동일한 건강인을 매일 2명씩 15일간 총 30명을 “일간 비교군”으로 선정하였다. 대상군 선정기준과 동일한 건강인 3명을 “염색실험군”으로 선정하였다.

2. 말초혈액도말표본의 제작: 표준 그리고 실험 염색프로토콜

연구대상자로부터 K2 EDTA 튜브(Becton; Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에 수집된 혈액검체는 자동슬라이드염색기(SP-10; Sysmex, Kobe, Japan)를 이용하여 말초혈액도말표본(표본)을 제작하였다. 표준 염색프로토콜을 요약하자면 다음과 같다. 순수 Wright 시약(RAL Diagnostics, Martillac, France) 2분 30초, 1:10 희석 Wright 시약(RAL Diagnostics) 3분, 1:25 희석 Giemsa 시약(RAL Diagnostics) 5분, 세척 15초, 그리고 건조 10분. 대상군으로부터 표준 염색프로토콜로 제작된 표본은 전문가 2인이 광학 현미경을 이용하여 독립적으로 관찰 및 평가하고 조사서를 작성하였다(Appendix 1). 조사서의 점수를 합산하여 2점 이상의 점수를 보이며 비정상 세포가 관찰되지 않은 표본을 “대상표본”으로 명명하였다. 일간 비교군으로부터 제작된 표본은 “일간 비교표본”으로 명명하였다. 표준 염색프로토콜의 설정값이 표준(standard)과 다른 경우 부적합 염색상으로 간주하였다. 다양한 부적합 염색상을 평가하기 위해 표준 염색프로토콜의 설정값을 임의로 변경한 실험 염색프로토콜을 염색실험군에 적용하였다. 실험 염색프로토콜은 고정시간을 변경하거나 Wright 또는 Giemsa 시약의 희석배수 또는 염색시간을 임의로 조정하였다. 실험 염색프로토콜로 제작된 표본은 “염색실험표본”으로 명명하였다. 표준 및 실험 염색프로토콜은 Table 1에 정리하였다.

Table 1 . The Wright-Giemsa staining procedure used in the standard staining protocol and the experimental staining protocol.

Staining protocol	Extra-fixation (min)*	Undiluted Wright (min)	Wright, min (dilution ratio)	Giemsa, min (dilution ratio)
Standard	-	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)
E1	-	2.5	3 (1:5)	5 (1:25)
E2	-	2.5	4 (1:5)	5 (1:25)
E3	-	2.5	4 (1:10)	5 (1:25)
E4	-	2.5	3 (1:10)	5 (1:13)
E5	-	2.5	3 (1:10)	8 (1:13)
E6	-	2.5	3 (1:10)	8 (1:25)
E7	-	4.5	4.5 (1:5)	5 (1:25)
E8	-	1.0	1 (1:10)	15 (1:9)
E9	-	4.5	1 (1:10)	5 (1:25)
E10	-	1.0	4.5 (1:5)	5 (1:25)
E11	1	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)
E12	2	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)
E13	3	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)
E14	4	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)
E15	5	2.5	3 (1:10)	5 (1:25)

*The blood smear was fixed on the slide using methyl alcohol prior to fixation by automated slide stainer..

3. 디지털 세포 이미지 분석기를 이용한 백혈구 감별

CellaVision DC-1 (CellaVision AB, Lund, Sweden)는 인공지능 기술을 이용하여 혈구세포를 자동으로 감별 및 디지털 이미지화하는 장비이다. 표본의 자동 백혈구 감별을 위해 장비의 설정값은 기본값을 유지하고 표본 1장당 200개의 세포(cell, CELL)를 호중구(neutrophil, NEU), 림프구(lymphocyte, LY), 단구(monocyte, mo), 호산구(eosinophil, EO), 그리고 호염기구(basophil, BA)로 감별하였다. 각 세포별 이미지의 개수(n)를 백분율(image counts [IMG_CELL]=n/200×100)로 계산하여 기록하였다.

4. 연구디자인

대상표본에서 디지털 세포 이미지 분석기를 이용하여 얻은 IMG_CELL 값과 자동혈구분석기(XN-9000, Sysmex, Kobe, Japan)로 계산된 complete blood count with differential count (DIFF_CELL) 간의 일치도를 평가한다. 일치도가 높은 세포에 대해 차이값(calculated values [VAL_CELL]=IMG_CELL–DIFF_CELL)을 구하고 VAL_CELL의 평균과 표준편차를 이용하여 평균±(2×표준편차) 이내를 허용범위로 하는 레비제닝스 관리도(Levey-Jennings control chart)를 그린다[9]. 일간 비교표본과 염색실험표본의 VAL_CELL 값을 레비제닝스 관리도에 기록하고 검토한다.

5. 통계학적 분석

대상군, 일간 비교군 그리고 염색실험군 간 정량적 또는 범주형 자료를 비교하기 위해 t-test 또는 Mann-Whitney U test, 또는 Pearson’s chi-square test를 사용하였다. IMG_CELL과 DIFF_CELL 간의 일치도는 급내상관계수(interclass correlation coefficient, ICC)를 구하였고, 판정기준은 0.80 이상 우수(good reliability), 0.60 이상에서 0.80 미만 중등(moderate reliability), 0.60 미만 불량(poor reliability)으로 하였다. 대상군에서 세포별 VAL_CELL의 표본집단의 평균, 표준편차, 그리고 평균의 95% 신뢰구간(confidence interval, CI)를 구하였다. 통계 처리는 Stata ver. 14.0 (Stata Corp., College Station, TX, USA)와 IBM SPSS ver. 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 사용하였다. 유의수준은 0.05 이하로 정하였다.

1. 연구대상

대상군 200명의 표본 중 전문가 평가를 통해 114명의 대상표본이 선정되어 총 22,800장의 이미지를 얻었다. 그리고 30건의 일간 비교표본과 15건의 염색실험표본으로부터 각각 6,000장, 3,000장의 백혈구 이미지를 얻었다. 대상군, 일간 비교군 그리고 염색실험군의 기본적인 특징은 Table 2로 정리하였다.

Table 2 . Basic characteristics of study, inter-day comparison, and staining experimental groups.

Characteristic	Study group (n=114)	Inter-day comparison group (n=30)	Staining experimental group (n=3)	P-value
Sex				0.198
Female	32 (28.1)	13 (43.3)	1 (33.3)
Male	82 (71.9)	17 (56.7)	2 (66.7)
Age (yr)	49 (42–56)	49 (43–52)	49 (46–55)	0.892
Hemoglobin (g/dL)	15.1 (13.7–15.8)	14.4 (13.6–15.3)	15.2 (12.4–16.6)	0.201
Platelet count (×109/L)	264 (233–308)	287 (259–316)	232 (210–234)	0.026
Leukocyte count (×109/L)	6.32 (6.02–6.81)	6.30 (6.10–6.57)	6.41 (6.24–6.53)	0.734
Neutrophil (%)	55.3 (50.1–58.7)	54.9 (51.0–57.8)	58.0 (44.6–62.0)	0.947
Lymphocyte (%)	34.6 (31.3–38.9)	35.8 (31.3–37.8)	31.6 (28.7–48.5)	0.963
Monocyte (%)	7.2 (6.5–8.0)	7.7 (6.2–8.5)	6.1 (4.9-7.7)	0.393
Eosinophil (%)	2.6 (1.6–3.5)	2.3 (1.6–2.9)	2.4 (1.4–2.7)	0.556
Basophil (%)	0.6 (0.4–0.7)	0.6 (0.5–0.7)	0.5 (0.3–0.6)	0.499

Values are presented as number (%) or median (interquartile range)..

2. IMG_CELL과 DIFF_CELL 간 일치도

전체 159건의 표본에 대한 호중구, 림프구, 단구, 호산구, 그리고 호염기구별 ICC는 각각 0.873, 0.586, 0.643, 0.351, 그리고 0.348이었다. 대상표본에서 세포별 ICC는 호중구와 림프구에서 각각 0.886, 0.826으로 우수한 일치도를 보였고 단구에서는 0.663으로 중등 일치도를 보였다. 호산구와 호염기구의 ICC는 각각 0.273, 0.382였다. 일간 비교표본에서는 호염기구(ICC, 0.266)를 제외한 나머지 세포에서 우수 또는 중등 일치도를 보였다(호중구 ICC, 0.894; 림프구 ICC, 0.864; 단구 ICC, 0.770; 호산구 ICC, 0.843).

3. 레비제닝스 관리도

대상표본에서 일치도가 가장 높은 호중구와 림프구를 대상으로 VAL_NEU와 VAL_LY을 계산하였다. VAL_NEU의 평균과 표준편차는 2.48±3.99 (95% CI, 1.75 to 3.21)였고, VAL_LY의 평균과 표준편차는 –2.32±4.62 (95% CI, –3.17 to –1.47)였다. VAL_NEU와 VAL_LY의 레비제닝스 관리도의 허용범위는 각각 –5.50 to 10.46과 –11.56 to 6.92였다. 전체 15건의 염색실험표본 중 3건(27.3%)의 VAL_NEU와 5건(33.3%)의 VAL_LY가 레비제닝스 관리도의 허용범위를 벗어났다(Fig. 1). 일간 비교표본의 VAL_NEU와 VAL_LY은 최소값이 각각 –4.50과 –9.20이고 최대값이 각각 9.30과 6.50으로 레비제닝스 관리도의 허용범위 이내의 결과였다(Fig. 2).

Figure 1. Digital images and quality index values of neutrophils (NEU) and lymphocytes (LY) according to the staining protocols in the staining experimental group. Values outside the allowable ranges from the Levey-Jennings control chart are indicated in italicized and underlined text. The VAL_NEU and VAL_LY are calculated as IMG_NEU–DIFF_NEU and IMG_LY–DIFF_LY, respectively. Abbreviations: VAL, calculated values; SD, standard deviation; IMG, image counts; DIFF, complete blood count with differential count.

Figure 2. (A, B) The Levey-Jennings control chart for the daily VAL_LEU and VAL_LY in two healthy individuals over 15 working days. Abbreviations: VAL, calculated values; NEU, neutrophils; LY, lymphocytes; SD, standard deviation.

저자들은 디지털 세포 이미지 분석기가 염색법의 질에 영향을 받을 수 있다는 점을 이용하여 세포염색법의 정도관리지표로 디지털 세포 이미지 분석기의 세포 이미지 백분율(IMG_CELL)과 자동혈구분석기의 세포 백분율(DIFF_CELL) 간 차이값(VAL_CELL)을 이용하였다. 염색실험표본과 일간 비교표본의 세포염색법의 적절성을 평가하기 위해 레비제닝스 관리도를 이용하였다. 염색조건을 달리한 15건의 염색실험표본 중 33.3%에서 레비제닝스 관리도의 허용범위를 벗어나는 결과를 보였으나 15일 동안의 2개의 서로 다른 정상인 검체를 이용한 일간 비교표본에서는 모두 허용범위를 만족하는 결과를 보였다. 이러한 결과로 미뤄보아 VAL_CELL은 세포염색법의 새로운 지표로 고려해볼 만하다.

하지만 염색실험표본 중 허용범위를 벗어난 11번부터 15번 표본은 다른 실험표본과 달리 광학현미경을 이용한 검경으로도 확인할 수 있는 명확한 부적절한 염색상이었으나, 염색실험표본 1번부터 10번과 같이 경도의 염색상 변화까지는 검출할 수 없다는 한계가 있었다(Fig. 1). 그리고 VAL_CELL은 염색상 변화의 정도를 반영하지는 않아 반정량적 지표에 가까웠다. 레비제닝스 관리도의 허용범위를 벗어난 염색실험표본 11번부터 15번은 고정시간이 길어지면서 부적절한 염색상의 정도도 심해지지만 VAL_CELL은 이러한 추세를 일관되게 반영하지는 못하고 있었다.

디지털 세포 이미지 분석기가 널리 보급되면서 인공지능을 활용한 세포의 감별 및 질병의 진단에 활용하는 연구도 활발히 진행되고 있다[8,10]. 하지만 염색법에 대한 기존의 정도관리 방식은 주관적이고 기관별 염색상에 차이가 있는 경우에는 인공지능을 활용한 진단프로그램의 이용 시 일관된 결과를 도출할 수 없는 문제점이 발생할 수 있다. 실제로 본 연구에서도 실험 염색프로토콜 중 부적절한 염색상으로 백혈구를 잘못 감별하는 경우가 193건이 있었다. 이들은 본 연구에서 제시한 질지표인 VAL_LEU 또는 VAL_LY에서 레비제닝스 관리도의 허용범위를 벗어난 염색상에서 모두 관찰되었다. 부적절하게 분류된 세포로는 blast가 51.3% (99/193)로 가장 많은 빈도를 차지하고 있었고, 뒤이어 myelocyte 43.5% (84/193), promyelocyte 3.6% (7/193), metamyelocyte 1.6% (3/193) 순이었다. 부적절하게 분류된 193건 중 191건(99.0%)은 실제로는 림프구였다. 나머지 2건(1.0%)은 metamyelocyte로 분류되었고, 그 중 1건은 실제로는 단구였고 나머지 1건은 염색상의 변화가 심하여 실제 세포를 판정할 수 없었다.

본 연구는 다음과 같은 한계점을 가지고 있다. 본 연구에서 사용된 CellaVision DC-1은 장비가 제시하는 백혈구 감별계산값을 숙련된 전문가가 이미지를 검토하여 결과값을 확정하는 것이 원칙인데, 이 과정 없이 장비가 산출한 결과값을 그대로 사용했으며, 혈액을 도말 및 염색하여 정상 검체임을 확인하였으나, 자동혈구측정기의 백혈구 감별계산값 역시 기준 방법인 전문가에 의한 수동 감별계산(manual differential count)에 의한 확인 없이 사용하여, 해당 혈액 도말의 백혈구 감별계산값의 참값 기준이 제시되지 않았으므로 정확한 평가라고 하기 어려운 점이 있다.

또한 CellaVision DC-1의 사용목적은, 본 연구에서 사용된 자동혈구측정기의 백혈구 감별계산이 유세포검사법으로 시행되므로 비정상 백혈구의 정확한 형태학적 감별이 불가능하므로, 인공지능을 사용하여 혈구형태가 비정상인 세포를 검사자에게 제시하고 확인받는 것이 중요한 목적인 바, 본 연구에서는 정상인을 대상으로 하여 CellaVision DC-1의 사용목적에 맞지 않게 연구되었다. 따라서 비정상 백혈구를 나타내는 혈액도말표본에 대하여 염색조건에 따라 CellaVision DC-1이 제시한 백혈구 감별계산값과 숙련된 전문가가 산출한 백혈구 감별계산값을 비교하여 평가하였다면 더 유용한 결과를 도출하였을 것으로 여겨진다.

결론적으로, 본 연구에서는 이미지 장비와 자동혈구분석기간 세포백분율의 차이값을 염색법의 질지표로 제시하고 레비제닝스 관리도를 이용한 질관리에 적용해본 결과, 부적절한 염색상을 검출할 수 있었다.

이 논문은 대한임상검사정도관리협회 2022년 학술연구비(2022-12) 지원에 의해 이루어진 것이다. 대상표본 선정에 도움주신 강북삼성병원 진단검사의학과 권민정 교수님께 감사드린다.