Acinetobacter 균속은 임상적으로 가장 중요한 Acinetobacter baumannii를 포함하여, 40종 이상의 명명된 종과 9종의 게놈 종으로 구성되어 있다[1]. A. baumannii는 주요 병원감염균으로 대부분이 카바페넴에 내성을 보이며, 다른 계열의 항균제에 대해서도 내성인 다제내성인 경우가 많다[2]. 이러한 특성으로 A. baumannii에 의한 패혈증, 심내막염 및 뇌수막염의 치료약제가 제한되며, 이러한 환자에서의 치명률이 매우 높다[3]. 이에 비해 A. baumannii 외의 Acinetobacter 균속(non-baumannii Acinetobacter spp.)은 대부분의 항균제에 대해 감수성을 잘 유지하고 있어, A. baumannii 감염에 비해 치료약제의 선택이 좀 더 용이하다[4]. 검사 소요시간이 긴 항균제 감수성 시험결과를 알기 전 치료방침을 세우는데, A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp. 균종을 정확히 구분하는 것은 두 균종의 항균제 감수성의 차이를 고려할 때 매우 유용한 정보이다.

Acinetobacter 균종들은 표현학적으로 매우 유사하기 때문에, 기존의 생화학적 검사로는 동정이 정확하지 않을 우려가 있어[5], 정확한 균 동정을 위해서는 A. baumannii에 intrinsic하게 존재하는 OXA-51 유전자를 polymerase chain reaction (PCR)로 검출하거나[6], Acinetobacter 균종들을 구분하기 위해 RNA polymerase β-subunit (rpoB)나 16S ribosomal RNA 유전자를 염기서열 분석하는 것이 추천되고 있다[7,8]. 하지만 이러한 방법은 검사실에서 통상적으로 이용하기는 검사 소요시간과 비용 면에서 적절하지 않다.

최근에는 Acinetobacter 균종의 동정에 matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)를 사용하는 검사실이 늘고 있다. MALDI-TOF MS를 이용하면 기존의 배양이 필요한 생화학적 방법에 비해 검사시간이 매우 단축되며[9], 이 검사법의 원리는 미생물의 고유한 질량 스펙트럼 지문을 생성한 후 확립된 지문 데이터베이스를 비교하여 균을 동정하는 것이다[10]. MALDI-TOF MS를 이용한 Acinetobacter 균종 동정의 정확도를 평가한 자료가 일부 있지만[11,12], 최근 자료는 거의 없어, 꾸준히 개선되고 있는 MALDI-TOF MS의 성능이 충분히 반영되지 않은 실정이다. 본 연구에서는 분자유전학적 방법과 비교하여 MALDI-TOF MS를 이용한 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.의 균종 동정의 정확성을 평가해 보고자 한다.

전국 9개 종합병원에서 2022년 1월부터 6월까지 혈액배양에서 분리된 A. baumannii를 포함한 모든 Acinetobacter 균종 총 225주를 대상으로 하였다. 실험 전까지 순배양 집락을 10% skim milk 배지에 분주하여 –70℃ 냉동고에 보관하였다가 실험 전날 혈액배지(Oxoid, Hampshire, England)에 계대 배양하여 사용하였다.

MALDI-TOF MS (Bruker MALDI Biotyper; Bruker Daltonics GmbH, Bremen, Germany)는 제조사의 지시대로 시험하고[12], MBT Biotyper RTC software ver. 3.1 (Bruker Daltonics)로 분석하였다. 균종 동정은 최적 일치 균주로 하였고, score value 2.0 미만은 다시 검사하여 동정을 재확인하였다.

분자유전학적 방법으로는 균종 동정을 위해 모든 균주에 대해 OXA-51 F (TAATGCTTTGATCGGCCTTG)와 OXA-51 R (TGGATTGCACTTCATCTTGG) 시발체를 이용한 PCR을 수행하여 353 bp의 blaOXA-51 유전자 증폭 산물을 확인하였다[13]. OXA-51 PCR 음성인 경우 rpoB F (CCTTCATGACCTGGAAYGGNTA)와 rpoB R (TCCAGGATCTGNCCNACRTTCAT) 시발체를 이용하여 PCR 후 940 bp의 rpoB 유전자의 증폭산물을 얻어 염기서열을 분석하였다[5]. 이를 위해 시험세균의 DNA 추출액 5 µL, 시발체 각 1 µL, deoxynucleotide triphosphates 2.5 mM (8 µL), Taq DNA polymerase 2.5 U (0.5 µL), 10× buffer 10 µL 및 증류수 75.5 µL를 혼합하여 PCR 반응액을 만들고 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer Centus Corp., Norwalk, CT, USA)으로 94℃ 5분+30×(94℃ 25초+52℃ 40초+72℃ 50초)+72℃ 6분의 반응조건으로 PCR을 시행하였다. 증폭산물 3 µL를 2.0% agarose gel (Promega, Madison, WI, USA)에 20분간 전기영동하여 증폭산물의 band를 확인하였다. 염기서열 분석은 PCR 증폭산물을 추출하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer (Applied Biosystems, Seoul, Korea)과 BigDye Terminator ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)을 이용하여 양방향으로 수행하였다. 균종 동정은 ABI 3730xl DNA Analyzer (Applied Biosystems)로 얻은 염기서열을 National Center for Biotechnology Information의 basic local alignment search data base로 분석하여 동일성이 가장 높은 균주로 하였다[14].

MALDI-TOF MS의 A. baumannii 동정능력을 blaOXA-51 PCR을 기준으로 categorical agreement를 구하여 비교하였고, non-baumannii Acinetobacter spp.의 균종 동정의 정확성은 rpoB 유전자의 염기서열법을 기준으로 평가하였다.

전체 225주 중 206주가 MALDI-TOF MS로 A. baumannii로 동정되었고, 모든 균주에서 PCR로 OXA-51 유전자가 검출되었다. MALDI-TOF MS로 non-baumannii Acinetobacter spp.로 동정된 19주는 모두 OXA-51 PCR 음성이었다. 따라서 OXA-51 PCR 결과를 기준으로 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.를 구분할 때 MALDI-TOF MS는 100%의 categorical agreement를 보였다(Table 1).

Table 1 . The concordance rate of species identification of Acinetobacter baumannii.

blaOXA-51 PCR	MALDI-TOF MS		Total
	A. baumannii	Acineterbacter spp.
Positive	206	0	206
Negative	0	19	19
Total	206	19	225

Categorical agreement (%)=(206+19)×100/225=100%..

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry..

전체 non-baumannii Acinetobacter spp.를 rpoB 유전자의 염기서열 분석결과를 기준으로 MALDI-TOF MS 분석결과를 분석해 보았을 때, 전체의 73.7% (14/19)가 종명까지 일치한 결과를 보였다(Table 2).

Table 2 . Results of MALDI-TOF MS and rpoB polymerase chain reaction-sequencing of non-baumannii Acinetobacter spp..

rpoB	MALDI-TOF MS	Score value (N)	Concordance rate % (N/N)
A. nosocomialis	A. nosocomialis	>2 (6), 1.7–2.0 (1)	100 (7/7)
A. bereziniae	A. bereziniae	>2.0 (3)	100 (3/3)
A. seifertii	A. nosocomialis	>2.0 (2)	0 (0/2)
A. soli	A. soli	>2.0 (1)	100 (1/1)
A. ursingii	A. ursingii	>2.0 (1)	100 (1/1)
A. pittii	A. pittii	>2.0 (1)	100 (1/1)
A. variabilis	A. variabilis	>2.0 (1)	100 (1/1)
A. junii	A. grimontii	>2.0 (1)	0 (0/1)
A. colistiniresistens	A. haemolyticus	1.7–2.0 (1)	0 (0/1)
A. oleivorans	A. calcoaceticus	1.7–2.0 (1)	0 (0/1)
Total		-	73.7 (14/19)

Abbreviations: MALDI-TOF MS, matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry; rpoB, RNA polymerase β-subunit; N, number; N/N, number of concordant isolates/number of subtotal isolates..

국내에서 분리된 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.의 항균제 감수성을 살펴보면[15], A. baumannii는 대부분의 항균제에 매우 높은 내성을 보이고 있으며, 2017년에서 2019년 혈액 분리주에서 piperacillin에 91.2%, ceftazidime에 88.3%, cefepime에 91.5%, imipenem에 90.5%, 그리고 meropenem에 90.5%의 균주가 내성을 보인다. 이에 비해 non-baumannii Acinetobacter spp.는 감수성을 잘 유지하고 있어 대부분의 항균제에 15% 미만의 내성률이 보고되어 있다. 특히 non-baumannii Acinetobacter spp.는 imipenem의 내성률이 10% 미만으로 A. baumannii와는 큰 차이를 보인다. Carbapenem에 내성인 A. baumannii라도 minocycline, tigecycline, 및 colistin에는 감수성이 잘 유지되고 있다. 항균제 감수성 결과의 차이가 큰 만큼 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.의 항균제 치료방향도 차이가 크므로[16], 신속하게 균종을 확인하는 것이 치료방침을 정하는 데 도움이 될 수 있다.

MALDI-TOF MS의 도입으로 균종 동정시간이 감소하였는데, 배양이 필요한 기존의 생화학적 동정의 84시간에서 MALDI-TOF MS로 동정 시 56시간으로 의미 있게 감소하였다[9]. 다만 MALDI-TOF에 의한 균종 동정은 균주에 따라서는 제한점이 있는데, 예를 들면 Shigella spp.가 Escherichia coli의 다양한 phylogenetic tree에 안에 존재하여 두 군의 구별이 명확치 않은 것을 들 수 있다[17]. 기존의 생화학적 검사로 Acinetobacter 균속의 정확한 균종 동정에 제한점이 있는 것은 잘 알려져 있기 때문에[5], MALDI-TOF MS를 적용하기 전에 Acinetobacter 균종 동정의 정확성을 확인해볼 필요가 있다. 특히 항균제 감수성 차이를 고려해볼 때 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.의 구별은 매우 중요하겠다.

기존의 MALDI-TOF MS법인 VITEK MS (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France)와 자동화 방법인 VITEK 2 (bioMérieux), 및 MicroScan WalkAway-96 Plus (Siemens, Deerfield, IL, USA)의 평가 보고에 의하면[11], rpoB 염기서열 분석을 기준으로 하였을 때, VITEK MS는 90.3%, VITEK 2는 89.2%, MicroScan은 86.9%가 종수준까지 일치한 결과를 보여 MALDI-TOF MS법이 자동화 방법보다 우수한 동정능력을 보였고, 특히 MALDI-TOF MS법은 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp.의 구분에서도 100% 일치하였다.

본 연구의 제한점으로는 blaOXA-51 유전자 양성인 경우 모두 A. baumannii으로 판단하였는데, 기존 보고에서 A. nosocomialis나 유전적으로 가까운 non-baumannii Acinetobacter spp.에서도 blaOXA-51 유전자의 위양성이 있으며, 위음성도 보고되어 있어[18], 절대적인 판단기준이 될 수 없다는 점이다. 또 다른 제한점으로는 다수의 기관에서 혈액분리 균주를 전수로 수집하였음에도 non-baumannii Acinetobacter spp. 균주 수가 충분하지 못하였다는 점이다. 하지만 본 연구를 통해 non-baumannii Acinetobacter spp.의 동정은 충분하지 않았으며, 가장 많이 분리되는 A. nosocomialis의 동정은 일치하였으나, 상대적으로 드물게 분리되는 균종들의 동정은 일치하지 않은 경우가 많았다는 경향은 확인할 수 있었다.

본 연구에 포함된 non-baumannii Acinetobacter spp.의 균주들은 최적의 경우 기존에 보고된 균종의 염기서열과 97.93%에서 100% 사이의 유사성을 보였다. 아직 rpoB 유전자 염기서열 분석법의 보고기준은 확립되어 있지 않으나, 기존의 연구에서 97.7%의 유사성을 가지는 경우 average nucleotide identity (ANI) 94.3%에 해당하고, 98.2%의 유사성을 가지는 경우 ANI 값 96% 정도에 해당된다고 보고되어 있다[19]. 따라서 non-baumannii Acinetobacter spp.의 rpoB 유전자 염기서열 분석법을 이용이 적절하였다고 판단하였다.

결론적으로, MALDI-TOF MS의 균종 동정은 치료약제의 선택의 유용한 정보인 A. baumannii와 non-baumannii Acinetobacter spp. 균종을 정확히 구분하는 데 매우 유용하였으나 정확한 종 수준까지의 non-baumannii Acinetobacter spp. 균종 동정에는 한계가 있었다.

이 연구는 대한임상정도관리협회의 학술연구과제 연구비 지원으로 수행되었다(과제번호: 2022-10). 균주를 제공해 주신 김영리(제주대학교병원 진단검사의학과), 김현수(한림대학교 동탄성심병원 진단검사의학과), 류남희(계명대학교 동산병원 진단검사의학과), 신경섭(충북대학교병원 진단검사의학과), 신정환(인제대학교 부산백병원 진단검사의학과), 신종희(전남대학교병원 진단검사의학과), 어영(연세대학교 원주의과대학 진단검사의학과), 및 정석훈(연세대학교 의과대학 진단검사의학과)께 감사드린다(존칭 생략, 가나다 순).