대한진단검사정도관리협회(‘대한임상검사정도관리협회’에서 변경)의 간염바이러스 항원항체검사 신빙도조사사업은 진단면역학 분야의 감염성 항원항체검사 중분류 검사의 프로그램으로서 2016년부터 폐기혈액을 이용한 자가제조 검체가 이용되고 있다. 신빙도조사 대상종목은 hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), hepatitis B virus surface antibody (anti-HBs), hepatitis B virus core antibody (anti-HBc) immunoglobulin G (IgG), anti-HBc immunoglobulin M (IgM), hepatitis B virus envelope antigen (HBeAg), hepatitis B virus envelope antibody (anti-HBe), hepatitis C virus antibody (anti-HCV), hepatitis A virus antibody (anti-HAV) total, anti-HAV IgG, anti-HAV IgM 총 10종이며, 총 4개 검체를 연 2회에 걸쳐 냉동 배송한다[1]. 매회차 발송 직전에 제조하여 단기 안정성 평가 후 냉동 발송되고 있으나, 안정적인 검체 제공을 위해서는 수개월 전에 사전 제조하여 냉동 보관 후 발송되는 프로세스가 요구된다. 따라서 본 연구에서는 폐기혈액을 이용하여 자가제조된 검체의 장기 안정성을 평가하여, 배송 후 냉장온도에서의 안정적인 보관기간을 확인하고, 추후 사전 제조 후 제공할 수 있는 근거자료를 마련하고자 하였다.

연구방법은 2019년 1회차 물질 4종류(IL-19-01, IL-19-02, IL-19-03, IL-19-04)를 제조할 때, 검체 종류별로 각 1 mL vial의 108개의 추가 검체, 총 432개 검체를 추가 제조하여 장기 안정성 평가에 이용하였다. 검체 제조에 사용된 혈장은 혈액원과 서울성모병원 혈액은행으로부터 폐기 예정 혈장을 분양 받아 사용하였으며, 자가제조물질은 대한진단검사정도관리협회의 신빙도조사용 자가제조 물질생산 지침에 따라 신선동결혈장(fresh frozen plasma)을 혈청으로 전환시킨 후 각 종목에 따라 적절한 역가가 되도록 양성 혈청을 혼합하여 제조하였다[1]. 제조과정을 간단히 기술하면 신선동결혈장에 thrombin 1 U/mL, 0.01 M CaCl₂를 첨가하고 37℃, 실온, −20℃, 실온에 각 2–4시간씩 보관하여 섬유소를 제거(defibrination)한 후 fibrinogen 농도가 25 mg/dL 미만이 되도록 하였다. 이후 해당 검사항목 양성 검체를 스파이킹하여 의도된 정성결과의 검체를 제조하고, 혼합제조 검체의 동질성 확보를 위해 4℃에서 18시간 동안 잘 혼합하였다. 최종 제조된 물질의 결과값을 확인하고 1 mL씩 분주하였다. 2019년 1회차 간염바이러스 항원항체검사 신빙도조사사업을 위한 4가지 검체의 검사항목과 의도한 정성적 결과(양성, 음성)를 Table 1에 표기하였다. 신빙도조사사업을 위한 자가제조 검체에 혼합되는 잔여 검체는 서울성모병원의 연구윤리심의위원회의 심의(KC19SESI0092) 승인 후에 사용하였으며, 동의서는 면제되었다.

Table 1 . Intended results of examination of external quality controls for Korean Association of External Quality Assessment Service on Hepatitis Serology (2019).

Sample	Test items	Intended results
Hepatitis serology
IL-19-01	HBsAg	P*
	HBeAg	P*
	HBcIgG	P*
	HBcIgM	N
	Anti-HBs	N
	Anti-HBe	N*
IL-19-02	HBsAg	N
	HBeAg	N
	HBcIgG	N
	HBcIgM	N
	Anti-HBs	P*
	Anti-HBe	N*
IL-19-03	Anti-HCV	N
	Anti-HAV total	N*
	Anti-HAV IgG	N
	Anti-HAV IgM	N
IL-19-04	Anti-HCV	P*
	Anti-HAV total	P
	Anti-HAV IgG	P
	Anti-HAV IgM	N

Abbreviations: P, positive; N, negative; HBsAg, hepatitis B virus surface antigen; HBeAg, hepatitis B virus envelope antigen; HBc, hepatitis B virus core; IgG, immunoglobulin G; IgM, immunoglobulin M; anti-HBs, hepatitis B virus surface antibody; anti-HBe, hepatitis B virus envelope antibody; anti-HCV, hepatitis C virus antibody; anti-HAV, hepatitis A virus antibody..

*Quantitative indices or concentrations (IU/L) were evaluated to assess the long-term stability of the sample..

장기 안정성 평가를 위해 평가일정에 따라 검체 종류별로 12개 검체를 실온 보관, 16개 검체를 냉장 보관, 38개를 −20℃ 냉동 보관, 38개를 −80℃ 냉동 보관하였고, 냉동해동 반복검사를 위해 4개 검체를 추가로 −80℃에 냉동 보관하였다. 보관된 조건에 따라, 실온 보관 검체는 2주 동안 보관하면서 1, 3, 5, 7, 10, 14일에 측정하였고, 냉장 보관 검체는 실온 검체의 측정일에 추가하여 3주와 4주에 측정하였다. 냉동 보관(−20℃, −80℃) 검체는 6개월 이상 장기 안정성을 평가하기 위해, 3개월 이후 12개월까지 매달 1회 추가로 검사하였다. 냉동해동 안정성 평가를 위해 −80℃ 보관 검체를 실온에 해동하고 다시 −80℃에 24시간 보관하는 과정을 4회 반복한 후 측정하여 초기 농도와 비교하였다. 모든 검체는 검체 검사스케줄에 따라 해당 검사일에 2개의 검체를 이용하여 신빙도조사 대상종목을 검사하였고, 2개 검체 검사결과의 평균값을 분석에 이용하였다(Table 2). 신빙도조사 대상종목 중 HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, anti-HCV, anti- HAV total, anti-HAV IgM 항목은 Roche사의 Elecsys 시약(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)을 이용하여 cobas E170 장비에서 측정하였고, HBc IgG와 HBc IgM 검사항목은 Abbott사의 Architect 전용시약(Abbott Diagnostics, Abbott Park, IL, USA)을 이용하여 Architect i2000 장비에서 측정하였다. 검사기관의 검사장비가 변경되어 7개월 이후의 결과는 분석에서 제외하였고, HBc IgG 검사는 시약의 lot가 변경되어 보관 후 3개월까지의 결과만 분석에 이용하였다. 각 검사의 내부정도관리는 검사를 시행하는 날마다 시행하였고, 정밀도는 index 값 10%–15% 이하(저농도 <15%)로 유지되었다. HAV IgG 검사항목은 제조기관의 측정장비에서 검사가 불가능하고 HAV total 검사결과로 대체할 수 있다고 판단하여, 장기 안정성 평가에 포함하지 않았다.

Table 2 . Test schedules and storage temperatures for stability testing.

Samples	Storage condition	No. of specimens	Time after preparation
			Day 1	Day 3	Day 5	Day 7	Day 10	Day 14	3 wk	4 wk	2 mo	3 mo	4 mo	5 mo	6 mo	7 mo	8 mo	9 mo	10 mo	11 mo	12 mo
IL-19-01	RT	12	2*	2	2	2	2	2
	2–8℃	16	2	2	2	2	2	2	2	2
	−20℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	−80℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	Freeze-thaw†	4										2			2
IL-19-02	RT	12	2	2	2	2	2	2
	2–8℃	16	2	2	2	2	2	2	2	2
	−20℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	−80℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	Freeze-thaw	4										2			2
IL-19-03	RT	12	2	2	2	2	2	2
	2–8℃	16	2	2	2	2	2	2	2	2
	−20℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	−80℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	Freeze-thaw	4										2			2
IL-19-04	RT	12	2	2	2	2	2	2
	2–8℃	16	2	2	2	2	2	2	2	2
	−20℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	−80℃	38	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
	Freeze-thaw	4										2			2

Abbreviation: RT, room temperature..

*Number of specimens tested. ^†Four freeze-thaw cycles..

장기 안정성 평가 기간에 4개 검체의 정성적 결과는 자가제조 당시의 검사결과와 안정성 평가 전체 검사스케줄에 해당하는 12개월까지 모두 일치하였다(100%). 장기 안정성 평가를 위하여, 정량적인 index 값, IU/L 농도, signal/cut-off (S/C) ratio 값을 분석에 사용하였다. 편차(%bias)는 해당 검사 시점에 측정한 값에서 초기 값의 평균값을 뺀 차이값을 초기 값으로 나눈 값의 백분율로 정의하였고, 장기 안정성에 대한 기준은 임의로 편차 10% 이하로 정하였다. 8개 항목에서 온도 및 검체 보관기간에 따른 정량적 값의 변화를 분석하여 Fig. 1에 표기하였다. IL-19-01 검체에서 HBsAg 결과는 냉장 온도에서 4주간 −4.6%에서 −0.3%의 편차를 모였고, −80℃에서 7개월간의 편차가 −5.8%에서 8.5%로 모두 10% 이내의 편차를 보였다. 실온 보관한 검체는 10일까지 안정적으로 HBsAg 결과가 유지되었으나 14일에 측정값 index가 증가하여 16.4%의 편차를 보였다(Fig. 1A). 마찬가지로 IL-19-01 검체에서 측정한 HBeAg 값도 실온 보관 5일 후부터 index 값이 10% 이상의 편차를 보였다(Fig. 1B). IL-19-01 검체에서 측정한 HBc IgG 검사결과는 냉동 보관 3개월까지 10% 이내의 편차를 보였다(Fig. 1C). IL-19-01 검체에서 측정한 anti-HBe 검사결과는 실온 보관 10일 이후에 −12.8%의 편차를 보였으나, 냉장 1개월, 냉동 7개월까지는 10.0% 이하의 편차를 보이면서 안정성이 유지되었다(Fig. 1D). Anti-HBs와 anti-HAV total 검사의 경우, 냉동 보관 시 2개월 이후부터 10% 이상의 편차를 보였는데, anti-HBs 검사결과는 증가하였고, anti-HAV 검사결과는 감소하는 경향을 보였다(Fig. 1E, G). Anti-HCV 검사결과는 실온 2주, 냉장 1개월, 냉동 7개월까지의 보관기간 동안 10% 이내의 편차를 보이며, S/C ratio 정량값이 안정적으로 유지되었다(Fig. 1H).

Figure 1. Changes in index values of hepatitis serology tests using prepared external quality materials stored at room temperature (RT), 2–8℃, －20℃, and －80℃. Samples from freeze-thaw 4 cycles also tested. (A) IL-19-01 HBsAg. (B) IL-19-01 HBeAg. (C) IL-19-01 HBc IgG. (D) IL-19-01 anti-HBe. (E) IL-19-02 anti-HBs. (F) IL-19-02 anti-HBe. (G) IL-19-03 anti-HAV total. (H) IL-19-04 anti-HCV. Abbreviations: RT, room temperature; HBsAg, hepatitis B virus surface antigen; HBeAg, hepatitis B virus envelope antigen; HBc, hepatitis B virus core; IgG, immunoglobulin G; anti-HBe, hepatitis B virus envelope antibody; anti-HBs, hepatitis B virus surface antibody; anti-HAV, hepatitis A virus antibody; anti-HCV, hepatitis C virus antibody; S/C, signal-to-cutoff.

본 연구결과, 간염바이러스 항원항체 검사항목의 양성 및 음성, 즉 정성적 결과값은 모든 보관조건에서 동일한 결과로 안정적인 경향을 보였다. 그러나 정량적 index 값의 편차를 분석한 결과, HBsAg, HBeAg anti-HBe 검사의 정량적 index 값은 실온에서 10일 이후 급격한 변화를 보였다. 냉장 온도에서 10일까지는 모든 검사의 정량적 index 값이 10% 이내의 편차를 보이며 안정적으로 유지되었다. −20℃와 −80℃에서 냉동 보관한 검체는 anti-HBs와 anti-HAV total을 제외하고, 모든 검사항목에 대해 3개월까지 안정성이 유지되었고, 4회까지 냉동해동한 검체에서도 안정성이 유지되었다. 이러한 결과는 혈청 검체의 안정성 유지를 위해 냉동 보관을 제안한 이전 연구보고와 유사한 결과이다. Yu 등[2]은 HBsAg 정량적 농도 202.0±23.1 IU/L 검체를 1년간 −20℃에서 냉동 보관 후 측정한 결과가 189.5±28.1 IU/L로 유의한 차이가 없음을 보고하였다. Henriksen 등[3]은 −80℃에 냉동 보관하였던 검체를 4–37℃에서 34일간 보관하면서 여러 가지 검사항목을 측정하여 검체의 안정성을 평가한 보고에서, 37℃에서 해동하여 보관한 검체는 13일 이후 검체 안정성이 현저히 저하됨을 보고하였다. Bae 등[4]은 LC-MS/MS (liquid chromatography-tandem mass spectrometry)로 측정하는 호르몬검사의 신빙도조사 물질의 안정성을 평가한 보고에서 혈장 검체는 실온에서 최소 24시간 보관할 수 있으며, 4℃ 및 −20℃에서는 8일간 보관이 가능하며, 그 이상의 장기보관이 필요한 경우 −80℃ 보관을 권장하였다. 본 연구의 결과를 고려하면, 제조된 검체의 역가가 낮은 양성 검체는 실온보관 후 위음성 결과를 나타낼 수 있다. 따라서 신빙도조사에 참여하는 검사실에서는 냉동 운송된 검체를 수령한 후 수일 내에 검사를 시행하는 것을 추천하며, 검사시행이 지연되는 경우는 냉장 보관하면서 가능한 10일 이내에 검사를 시행해야 할 것으로 판단된다.

본 연구에서 −20℃와 −80℃에 냉동 보관하면서 안정성을 평가한 결과, anti-HBs, anti-HAV 검사값은 2개월 이후 10% 이상의 정량값 차이를 보였다. 본 연구에서는 정량값 index를 이용하여 장기 안정성에 대한 기준을 편차 10% 이하로 정하여 평가하였는데, 간염바이러스 항원항체검사는 정성검사이고, 정량적 index 값의 직선성이 확보되지 않는 정성검사이므로 검사법과 정밀도에 의한 영향이 고려되어야 한다. 혈청 검체의 안정성 평가기준은 10%–30%로 다양하게 보고되어 있으나, 명확한 기준이 정립되어 있지 않다. 유럽의약품청(European Medicines Agency) 가이드라인에서는 20% 이내의 농도변화를 허용범위로 제안하고 있으며[5], Engelmaier 등[6]은 혈청 검체에서 박테리아 항체량의 안정성을 연구한 보고에서, 리간드 결합 면역분석법을 이용하여 항체역가의 안정성을 측정할 경우, 반복 측정한 검체들의 3분의 2 이상에서 30% 이내의 변화를 허용기준으로 제시하였다. 본 연구에서 냉동 보관된 검체에서의 anti-HBs index 값은 −20℃ 보관 검체에서 −2.0%–19.0%, −80℃에서 −0.8%–21.4%의 편차를 보였고, anti-HAV index 값은 −20℃에서 −20.6%, −80℃에서 −25.6%의 편차를 보였으므로, 모두 30% 이내의 편차를 유지하였다. 추후 바이러스 항체의 정성검사용 검체의 장기 안정성을 객관적으로 평가할 수 있는 편차 기준의 확립 연구가 필요할 것으로 판단된다.

본 연구의 제한점은 장기 안정성 평가에 사용된 자가제조물질 제조를 위해 신선동결혈장을 혈청으로 전환시킨 후 양성 혈청을 혼합하여 제조하였으나, 환자 검체를 혼주함으로써 발생할 수 있는 기질효과의 영향을 평가하지 않았다는 것이다. 혼주된 혈청에 포함된 특정 환자의 검체가 측정값에 영향을 미칠 수 있으며, 검체의 장기 안정성에도 영향을 줄 수 있음을 염두에 두어야 할 것이다[7]. 또한 IgM 일부 검사항목의 index 값은 음성 검체만 이용하였고, non-competitive 면역분석법에 의한 index 정량값이 0.5 이하로 낮아서 정량값 편차 분석에서 배제하였으며, 7개월–1년은 시행기관의 검사장비가 교체되어 분석할 수 없었다.

결론적으로, 바이러스 항원항체검사를 위한 자가제조 검체는 냉장온도에서 10일까지, −20℃와 −80℃에서는 3개월까지(anti-HBs, anti-HAV total은 2개월까지), 냉동해동은 4회까지 모든 검사의 정량적 index 값이 10% 이내의 편차를 보이며 안정성이 유지됨을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 간염바이러스 항원항체검사 신빙도조사사업의 안정적인 수행과 질향상에 기여할 것으로 판단한다.

이 연구는 대한진단검사정도관리협회(‘대한임상검사정도관리협회’에서 변경)의 2019년도 학술연구과제 연구비 지원으로 수행되었다(과제번호:2019-06).