Lab Med Qual Assur 2024; 46(4): 225-229
Published online December 31, 2024
https://doi.org/10.15263/jlmqa.2024.46.4.225
Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.
Department of Laboratory Medicine, Chosun University College of Medicine, Gwangju, Korea
Correspondence to:Geon Park
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BK virus (BKV) infection and reactivation increase the risk of BKV-associated nephropathy and allograft failure in immune-compromised individuals; the condition could be managed by reducing immunosuppressive medication. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) screening for BKV has become the standard of care. The 1st World Health Organization International Standard for BKV DNA was introduced in 2016, facilitating standardizing and comparing various BKV qPCR assays. The Korean Association of External Quality Assessment Service (KEQAS) changed the reporting unit of BKV qPCR from log10 copies/mL to log10 IU/mL in 2024. This article shares our experience with calculating the conversion factor for copies-to-international units (IU) using standard materials. The conversion factors derived by Real-Q BK Virus Quantification Kit for plasma and urine were 0.48 and 0.19, respectively. The inconsistent performance of two identical nucleic acid extraction instruments was revealed, highlighting one of the various factors contributing to the variability of BKV quantification. We also considered the effects of changing the reporting unit on external quality assessment and standardization in general. Following the change, the KEQAS showed decreased interlaboratory variability. Switching the reporting unit to IU is expected to reduce inter-assay variability, providing each laboratory establishes and uses its conversion factor.
Keywords: BK virus, Standardization, International Standard, Conversion factor, International unit, Quantitative polymerase chain reaction
BK virus (BKV)는 Polyomaviridae에 속하며 외피가 없는 이중나선 DNA 바이러스다[1]. 인구 대다수가 유년기에 감염되어 성인의 90% 정도 잠복 감염된 것으로 알려져 있다[2]. 신장이식 및 조혈모세포이식 등 면역억제 상태에서 재활성되어 BKV-associated nephropathy (BKVAN)나 출혈방광염을 일으키며, 특히 BKVAN는 이식편거부반응과 사망률 증가로 이어질 수 있다[3]. Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO)는 신이식 후 첫 3–6개월 동안 매달 혈장 BKV DNA 정량검사(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)를 실시하고, 지속적으로 10,000 copies/mL 이상일 경우 면역억제제 용량을 줄일 것을 권고하고 있다[4]. qPCR을 이용한 바이러스뇨증과 바이러스혈증 감시는 BKV 감염 조기진단과 선행적 면역억제치료 감소를 가능케 해 BKVAN 위험도 감소와 예후 개선에 도움이 된다[4]. 국내 이식 환자 증가로 BKV DNA qPCR에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있어 바이러스의 정확한 정량과 BKV 선별지침의 일관된 적용을 위해 BKV qPCR 결과값에 영향을 줄 수 있는 여러 변수를 최소화할 필요가 있으며, World Health Organization (WHO)과 National Institute of Standards and Technology (NIST)의 BKV DNA 표준물질과 상용화된 이차표준물질을 이용하여 BKV DNA qPCR의 표준화를 실시해야 한다. 그러나 표준물질을 이용한 표준화는 미비한 실정이다[2]. 대한진단검사정도관리협회 신빙도조사사업 바이러스 분자검사 항목(신빙도) 중 BKV 정량검사의 보고단위가 2024년부터 log10 copies/mL에서 log10 IU/mL로 변경되어 표준화를 위한 물꼬를 텄다.
본 검사실에서도 변경된 보고단위에 맞춰 보고하기 위해 WHO BKV 표준물질로 IU/copies 변환계수를 산출하였으며, 그 경험을 공유하고 검사실마다 직접 변환계수를 산출해서 사용해야 하는 이유를 고찰하고자 하였다. 또한 신빙도 보고단위 변경의 효과를 분석하고자 하였다.
본 검사실에서의 변환계수 산출은 1st WHO International Standard를 이용하여 Semenova 등[5]이 발표한 프로토콜을 일부 수정하여 수행하였다. WHO BKV DNA 표준물질(NIBSC code: 14/212)은 2016년 제작되었으며, BKV 1b-2 아형을 Tris-HCl과 0.5% 사람 혈청 알부민 등이 포함된 완충액에 녹여 동결 건조한 형태이며, 농도는 7.2 log10 IU/mL로 맞춰져 있다[6]. 산출과정을 간단히 정리하면 다음과 같다. 표준물질은 NIBSC 지침에 따라 멸균한 2차 증류수 1 mL를 분주하고 20분 동안 흔들어 재구성하였다. 이 표준물질 희석을 위해 임상의의 처방에 따라 BKV DNA qPCR을 수행 후 음성으로 확인된 폐기 예정인 K2-EDTA 혈장 잔여 검체와 소변 잔여 검체를 각각 사용하여 20배수, 200배수 그리고 2,000배수의 혈장 인공 검체 3개와 소변 인공 검체 3개를 제조하였다. Fig. 1과 같이 2대의 Real-Prep System (BioSewoom, Seoul, Korea)으로 혈장 및 소변 인공 검체에서 핵산을 추출하고 CFX96 DX (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)와 Real-Q BK Virus Quantification Kit (Real-Q BKV) (BioSewoom)로 qPCR를 수행하였다. 모든 검사과정은 회사 지침에 따랐으며, 모든 검체를 2회 반복 검사하는 과정을 3일간 시행하였다. 표준물질의 기대 측정값인 1.58×107 (IU/mL)를 36개 인공 검체 측정값(copies/mL)에 각각의 희석배수로 곱한 값들의 기하평균(geometric mean)으로 나누어 변환계수(IU/copies)를 산출하였다(Fig. 1A).
이 프로토콜로 산출된 핵산 추출장비별 혈장의 변환계수는 0.72 IU/copies와 0.48 IU/copies였으며, 소변의 변환계수는 0.21 IU/copies와 0.19 IU/copies였다. 검체 종류 및 핵산 추출장비별 정량값에 희석배수를 곱한 값들의 coefficient of variation (CV, %)는 혈장은 1.6과 1.3 그리고 소변은 0.6과 0.7이었다. 검사실 내부적으로 두 추출장비로 얻어진 검체별 산출계수의 평균을 이용할지 아니면 더 높은 추출 성능을 보이는 한 장비만을 사용할 것인지에 대해 논의가 있었다. 바이러스 DNA 정량검사에서 의미 있는 차이를 0.5 log10 copies/mL로 설정한다면 본 검사실 2대의 핵산 추출장비 간 정량값은 혈장과 소변 검체 모두에서 유의한 차이가 관찰되지 않았으나[7], 추출장비별 CV 차이는 적으므로 추출 성능이 상대적으로 더 좋은 한 장비만을 사용하는 것이 더 일관성 있는 정량값을 제공할 수 있을 것이라는 결론에 도달하여 혈장과 소변의 각각의 변환계수를 0.48 IU/copies와 0.19 IU/copies로 정의하였다(Fig. 1B, Table 1). qPCR 검사의 비정확도와 변동성의 원인으로는 검체의 종류, 안정제 사용 여부, 핵산 추출기법, 시발체, 소식자, 바이러스 변이 및 검사시약 종류 등이 있으며, 이 중 가장 큰 원인은 핵산을 추출하는 과정에 있다[3,7]. 따라서 높은 핵산 추출 수율이 qPCR에 중요하며, 특히 소변 내 PCR 억제제를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 사용해야 한다[7]. 앞서 기술한 것처럼 추출장비 간 유의한 차이는 없었으나, Fig. 1B에서 볼 수 있듯이 BKV qPCR 검사에 단독으로 사용하기로 한 추출장비의 추출 성능이 더 좋았다. 이렇듯 같은 모델의 추출장비에서도 장비마다 차이가 있을 수 있으므로 2대 이상의 추출장비를 사용하는 경우 장비 평가 후 더 나은 성능의 장비를 선택하는 것이 필요할 것으로 생각된다. 참고로 제조사가 본 검사실에 제공한 혈장 변환계수는 0.37이었으며, 이 변환계수 산출을 위해 1st WHO International Standard와 QIAamp DSP virus spin kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하였다고 한다. 소변의 변환계수는 제공하지 않았다. 한 문헌에서는 제조사가 제공한 혈장 변환계수가 0.39라고 기술되어 약간의 차이가 있었다[3]. kPCR PLX BKV DNA assay (Siemens Healthcare Diagnostics, Saint Denis, France), Versant kPCR Molecular systems AD (Siemens Healthcare Diagnostics) 그리고 Versant sample preparation 1.2 reagents (Siemens Healthcare Diagnostics)를 이용한 한 연구에서 plasma 및 urine의 conversion factors는 각각 1.67 및 0.33이었다고 보고하였다(Table 1) [8]. 만약 본 검사실에서 WHO 표준물질을 이용하여 직접 변환계수를 산출하지 않고 제조사에서 제공한 변환계수를 사용하였다면 정량값이 B 추출장비는 1.29배(0.48/0.37) 그리고 A 추출장비는 1.95배(0.72/0.37) 차이가 발생했을 것으로 생각된다(Fig. 1B).
Table 1 . Conversion factors (IU/copies) derived from various BK virus quantification PCR procedures
Reagent | Real-time PCR machines | Nucleic acid extraction instruments | Extraction kits | Conversion factor | References | ||
---|---|---|---|---|---|---|---|
Plasma | Urine | ||||||
Real-Q BK Virus | CFX96 DX | Real-Prep | Real-Prep | 0.48 | 0.19 | This study | |
NS | QIAamp DSP virus spin kit | 0.37 | NS | Company-provided | |||
kPCR PLX BKV DNA assay | Versant kPCR Molecular systems AD | NS | Versant sample preparation 1.2 reagents | 1.67 | 0.33 | [8] |
Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; NS, not specified.
WHO BKV 표준물질의 개발과정을 참조하면 검사실에서 왜 표준물질을 이용하여 자체적인 변환계수를 산출해서 사용해야 하는지 알 수 있다. BKV를 MRC-5 세포주에 접종 후 얻어진 배양액에서 BKV ELITe MGB kit (EliTech Group, Torino, Italy)로 BKV qPCR를 실시하고 BKV 바이러스 부하를 7.0 log10 copies/mL로 잠정 결정하였다. 이 배양액을 동결 건조하여 다양한 추출방법, qPCR 시약 및 qPCR 장비 등을 사용하는 여러 검사실에 보내어 BKV 부하를 정량하게 한 후 그 평균인 7.17 log10 copies/mL를 7.2 log10 IU/mL로 정의하였다. 7.2 log10 IU/mL는 qPCR 정량값에 영향을 미치는 변수가 서로 상이한 여러 검사실의 평균값이고 qPCR 시약업체가 제공하는 변환계수도 각 검사실의 특수성을 모두 고려하지 않는다는 것을 주지해야 한다[2].
또한 WHO 표준물질을 이용하여 산출된 EBV qPCR의 변환계수에 대한 다기관 연구에서 동일한 추출장비, qPCR 시약, qPCR 장비 그리고 산출 프로토콜을 이용한 두 검사실의 변환계수는 각각 0.31과 0.77로 두 배가 넘는 차이를 보였다[5]. 추출장비, qPCR 장비의 차이는 무시한 채 qPCR 시약 한 종류에 대해 분석 시, 시약 제조사는 0.952를 변화계수로 제시하였으나 여섯 검사실에서 자체 설정한 값은 0.31–2.09(중앙값, 0.87; 표준편차, 0.68)로 보고하였다[5]. 이러한 현상은 BKV qPCR에서도 관찰될 것이라 추측된다. 주요 변수가 모두 동일하여도 변환계수는 크게 차이가 날 수 있으므로 동일한 검사장비와 시약을 이용하는 타 검사실의 변환계수를 사용해서는 안 되고 검사실에서 직접 변환계수를 산출하는 것이 필요할 것으로 생각된다.
신빙도에 따르면 총 29개 기관이 2024년 1차 조사에 참여하였으며 12기관(41%)이 Real-Q BKV, 6기관(21%)이 Roche Cobas 5800/6800/8800 BKV, 5기관(17%)이 ELITe-MGB kit (EliTech Group), 그리고 6기관(21%)이 기타 검사법을 사용하였다. 보고단위 변경 전인 2023년 2차에는 총 26개 기관이 참여했고, 12기관(46%)이 Real-Q BKV를 사용하였다. 각 회차별 2개의 양성 물질 결과값은 Table 2와 같이 조사되었다. KDIGO에서 면역억제제 용량 변경기준으로 제시한 BKV 농도인 10,000 copies/mL와 가장 근사값을 갖는 신빙도 물질인 GV1-23-53와 GV1-24-24의 CV를 비교하면 보고단위 변경 후 전체 기관과 Real-Q BKV를 사용한 기관 모두에서 감소하였다. 2024년 신빙도 보고단위 변경에 따라 copies/mL 단위를 사용하던 기관들은 변환계수가 필요하게 되었다. 일부 검사실에서는 제조사에서 제공한 변환계수를 사용하고, 일부는 직접 산출한 변환계수를 사용하였을 것으로 생각된다. 참고로 Real-Q BKV는 copies/mL만, Roche Cobas 5800/6800/8800 BKV는 IU/mL만, 그리고 ELITe-MGB kit는 copies/mL와 IU/mL를 모두 제공하고 있다. Roche Cobas 5800/6800/8800 BKV와 ELITe-MGB kit는 핵산 추출부터 정량까지 일체화된 자동화 장비로 수행하나, Real-Q BKV는 검사실마다 상이한 핵산 추출방법을 사용하여 검사실 간 차이가 더 클 수 있다. IU/mL 단위로 보고하기 위해서는 mL당 IU로 정량값이 표시된 표준물질로 변환계수를 산출해야 하므로, IU/mL로 보고하는 것이 copies/mL로 보고하는 것보다 바이어스가 작다고 알려져 있다[6,7]. 보고단위 변경 후 어느 정도 표준화가 이루어져 전체 기관과 Real-Q BKV를 사용한 기관 모두에서 CV가 감소하였을 것으로 생각된다.
Table 2 . BK virus quantitative PCR external proficiency test results of the Korean Association of External Quality Assessment Service
Sample | Reagent: Real-Q BK Virus Quantification Kit | Reagent: all | |||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
No. (%)* | Reported result range† | Median† | CV (%) | No. (%)* | Reported result range† | Median† | CV (%) | ||
GV1-23-53 | 12 (41) | 3.75–4.32 | 4.05 | 4.3 | 29 (100) | 2.97–4.32 | 3.93 | 10.4 | |
GV1-23-54 | 2.83–3.53 | 3.21 | 6.2 | 2.06–3.53 | 2.96 | 14.7 | |||
GV1-24-24 | 12 (46) | 3.79–4.21 | 3.89 | 3.7 | 26 (100) | 2.13–4.68 | 3.89 | 6.8 | |
GV1-24-25 | 4.80–5.58 | 5.26 | 3.9 | 3.33–5.96 | 5.44 | 5.2 |
Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; CV, coefficient of variation.
*Number (percentage) of laboratories using specified reagent. †The units for GV1-23-53 and GV1-23-54 are log10 copies/mL, while the units for GV1-24-24 and GV1-24-25 are log10 IU/mL.
한편, 본 연구에서 이용한 WHO BKV 표준물질을 차세대염기서열분석법으로 deep sequencing한 연구결과에 따르면, 이 표준물질에 large T antigen 영역을 거치는 결실을 가지는 BKV가 일부 섞여 있다고 한다[9]. 따라서 qPCR 시약의 타깃 영역이 어디인지에 따라 WHO 표준물질의 정량값에 차이가 발생할 수 있다. Real-Q BKV와 Roche Cobas 5/6/8800 BKV는 각각 viral protein 1과 viral protein 2 & small t-antigens를 타깃으로 한다[3].
정량 표준물질 WHO NIBSC code: 14/212의 농도와 단위는 7.2 log10 IU/mL로 국제 표준단위로 표시되어 있으며, NIST SRM 2365의 농도와 단위는 558,000 copies/µL이다. 변환계수는 상기 일차표준물질 또는 상용화된 더 낮은 단계의 표준물질을 사용하여 산출할 수 있다. 표준물질 선택 시 주의할 점이 있다. 일부 표준물질의 경우 copies/mL 단위만 제공하거나 변환계수를 함께 제공하는데, 이 표준물질의 사용이 정량값의 진실성에 어떤 영향을 미칠지는 불확실하며, 개별 검사실에서 변환계수를 산출할 경우 제조사에서 제공하는 변환계수를 사용할 때보다 측정 불확도와 바이어스가 더 증가할 수 있다는 주장도 있다[6]. 따라서 표준물질을 구입하고자 하는 경우 IU/mL 단위의 정량값을 제시하는지 확인할 필요가 있다.
결론적으로, BKV qPCR에 영향을 미치는 많은 변수가 있으므로 BKV qPCR를 수행하는 각 검사실에서는 IU/mL 단위로 정량값이 표시된 표준물질로 자신만의 변환계수를 산출하여 결과 보고에 이용해야 할 것으로 생각된다.
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