페록시좀 질환(peroxisomal disorders) 환자들은 프리스탄산(pristanic acid) 및 피탄산(phytanic acid) 등과 같은 분지 사슬 지방산(branched-chain fatty acids)의 충분한 섭취가 이루어지면 혈장 프리스탄산 및 피탄산 농도가 증가한다[1]. 혈장 프리스탄산 및 피탄산의 신뢰할 수 있는 정량화는 페록시좀 질환 환자를 평가하는 데 필수적이다. 이에 저자들은 혈장 검체에서 프리스탄산 및 피탄산을 정량화하기 위한 기체 크로마토그래피 질량분석법(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 검사법을 구현하고 검증했다[1].

20 µM ²H₃-프리스탄산 및 80 µM ²H₃-피탄산(Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA)을 내부표준물질로 분석하여 GC-MS 검사법을 개발했다. 검체 전처리에는 아세토니트릴(acetonitrile)을 혼합한 HCl을 이용한 산 가수분해 및 메탄올(methanol)을 혼합한 NaOH를 이용한 알칼리 가수분해, 헥산(hexane)을 이용한 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction), 유기 용매의 증발, N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) 및 피리딘(pyridine)에 의한 유도체화가 포함되었다. 길이 30 m, 내경(inner diameter) 0.25 mm, 필름 두께 0.25 µm인 HP-5MS (Agilent, Folsom, CA, USA) 컬럼이 장착된 7890B-5977B GC-MS (Agilent, Waldbronn, Germany) 장비를 사용하였고, 헬륨은 운반가스로 사용되었다. 질량분석기는 전구체(precursor)에서 생성물 이온(product ions)으로의 전이(transition)를 통해 구동되었다. 프리스탄산, 피탄산, 프리스탄산-내부표준물질 및 피탄산-내부표준물질 각각의 mass-to-charge ratio (m/z)은 다음과 같다(m/z: 355, 369, 358, 372). 프리스탄산, 피탄산, 프리스탄산-내부표준물질 및 피탄산-내부표준물질의 각각의 머무름 시간(retention times)은 다음과 같다(전체 26.83분 분석에서 각각 19.33, 20.39, 19.31, 20.38분).

분석장비 조건은 Table 1 (GC 조건), Table 2 (MS 조건)에 제시한 바와 같다. 본 연구에서는 검사법을 평가하기 위해 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에 제시된 평가지침 및 문헌에 따라 GC-MS법을 이용하여 측정한 혈장 프리스탄산 및 피탄산 농도에 대하여 정밀도, 직선성, 회수율 및 잔효를 평가하였다[2-9]. 각각의 평가에 대한 통계는 Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

Table 1 . Analytical instrument conditions for gas chromatography.

Variable	Values/features
Columns
Run time (min)	26.83
Flow (mL/min)	1
Pressure (psi)	8.20
Average velocity (cm/sec)	36.62
Holdup time (min)	1.37
Post run (mL/min)	1.30
Front injector
Syringe size (μL)	10.00
Injection volume (μL)	1.50
Plunger speed	Fast
Wash vial solvent	Hexane
Inlets
Carrier gas control	Constant flow–helium
Mode	Split
Split ratio	10:1
Split flow (mL/min)	10
Oven program
Initial temperature	60℃ for 1.00 min
Ramp 1	30℃/min to 160℃, hold for 0.00 min
Ramp 2	5℃/min to 230℃, hold for 0.00 min
Ramp 3	20℃/min to 230℃, hold for 5.00 min
Post run	300℃

Table 2 . Analytical instrument conditions for mass spectrometry.

Variable	Values/features
Ion mode	Electron ionization
Source temperature (℃)	250
Quadrupole temperature (℃)	150
Electron energy (eV)	70
Emission (µA)	34.60
Repeller (V)	31.11
Entrance lens (V)	17.60
Extractor lens (V)	0.00

정밀도는 ERNDIM Control Special Assays in Serum(물질번호 SAS2019.01, SAS2019.04, SAS2019.05, SAS-02.1 [lot. no. 2018.2161], SAS-02.2 [lot. no. 2018.2162]; MCA Laboratory, Winterswijk, Netherlands) 세 가지 각각 다른 농도의 외부정도관리물질을 이용하여 1일 1시행(run)씩, 시행당 3회, 3일 동안, 그리고 추가적으로 1일 3시행씩, 시행당 1회, 20일 동안 반복 측정하여 두 번에 걸쳐 평가하였다. 20일 추가정밀도 평가의 경우, 각각의 정도관리물질을 20일 동안 매일 3시행씩, 시행당 1회씩 반복 측정하여 평가하였다[2,3]. 정밀도의 허용기준은 <±15%로 설정하였다[4].

직선성은 CLSI EP06-A에 따라 평가하였다[5]. 프리스탄산 및 피탄산 표준품(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 톨루엔(toluene)으로 희석하여 검량선(calibration curve) 시료를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 직선성을 확인할 수 있는 농도의 물질을 조제하였다. 이들을 각각 3회씩 반복 측정하여 그 결과를 이용하여 직선성을 평가하였다.

회수율은 ERNDIM Control Special Assays in Serum(물질번호 SAS2019.01, SAS2019.04, SAS2019.05; MCA Laboratory, Winterswijk, Netherlands) 세 가지의 각각 다른 농도의 외부정도관리물질을 이용하여 1일 3회, 3일간 분석하여 평가하였다[6].

잔효는 [(L1–L3)/(H2–L3)]×100 계산식으로 구하여 평가하였고, 허용기준은 <±1.0%로 설정하였다[7-9]. 프리스탄산 및 피탄산의 잔효는 각각 0.001%, –0.008%로 허용기준을 만족하였다.

각 종목별 정밀도 평가결과를 Table 3에 제시하였다. 각 종목별 정밀도 평가결과 총 변이계수는 2.60%에서 4.58% 수준의 값을 보였다[4]. Fig. 1은 프리스탄산 및 피탄산 검사항목의 직선성 평가결과를 보여주는 그래프이다. 직선성 평가에서 두 종목 모두 결정계수가 0.99 이상이었다. 각 종목별 회수율 평가결과를 Table 4에 제시하였다. 각 종목별 회수율 평가결과 회수율은 92.30%에서 109.09% 수준의 값을 보였다[4].

Table 3 . Precision of pristanic acid and phytanic acid measurements by gas chromatography-mass spectrometry with high-, medium-, and low-level quality control materials.

Items	Level (μmol/L)	Mean±standard deviation (μmol/L)	Coefficient of variation (%)
Pristanic acid	Low	0.63±0.02	2.60
	Medium	1.27±0.05	4.24
	High	3.70±0.15	3.97
Phytanic acid	Low	2.58±0.07	2.87
	Medium	5.33±0.24	4.58
	High	13.76±0.44	3.20

Table 4 . Recovery of pristanic acid and phytanic acid measurements by gas chromatography-mass spectrometry with high-, medium-, and low-level quality control materials.

Items	Assigned (μmol/L)	Mean±standard deviation (μmol/L)	Coefficient of variation (%)	Recovery (%)
Pristanic acid	0.44	0.48±0.02	3.29	109.09
	2.15	2.23±0.06	2.63	103.91
	6.20	6.38±0.23	3.73	102.90
Phytanic acid	3.48	3.43±0.12	3.43	98.51
	9.50	9.39±0.11	1.12	98.85
	15.70	14.49±0.28	1.90	92.30

Figure 1. Linearity analyses by gas chromatography-mass spectrometry method measurements. (A) Pristanic acid. (B) Phytanic acid.

GC-MS법을 이용한 혈장 프리스탄산 및 피탄산의 농도 측정은 정밀도, 직선성, 회수율, 잔효에 있어서 매우 만족할 만한 결과를 보였다. 따라서 혈장 프리스탄산 및 피탄산 GC-MS 검사법은 연구목적뿐 아니라 임상검사 목적으로도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.