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pISSN 2950-9114 eISSN 2950-9122
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Evaluation Brief

Lab Med Qual Assur 2021; 43(3): 162-165

Published online September 30, 2021

https://doi.org/10.15263/jlmqa.2021.43.3.162

Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.

Implementation and Validation of a Gas Chromatography-Mass Spectrometry Method for Pristanic Acid and Phytanic Acid Quantification in Plasma Specimens

Ahram Yi *, Jun Hyung Lee *, Gahyun Yoo , Hye Jin Lim , Euna Park , Jungsun Han , Geun Young Kim , Sung-Eun Cho , Sang Gon Lee , and Eun Hee Lee

Department of Laboratory Medicine, Green Cross Laboratories (GC Labs), Yongin, Korea

Correspondence to:Sung-Eun Cho
Department of Laboratory Medicine, Green Cross Laboratories (GC Labs), 107, Ihyeon-ro 30beon-gil, Giheung-gu, Yongin 16924, Korea
Tel +82-31-260-0947
E-mail secho1206!!@gclabs.co.kr
*These two authors contributed equally to this manuscript.

Received: July 21, 2021; Revised: August 3, 2021; Accepted: August 9, 2021

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

We validated a gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method for quantifying pristanic acid (PrA) and phytanic acid (PhA) in plasma specimens. We developed a GC-MS method based on the analysis of 20 μM 2H3-pristanic acid (PrA-IS) and 80 μM 2H3-phytanic acid (PhA-IS) as internal standards. The GC-MS was fitted with a 30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5MS (Agilent, USA) column. The mass spectrometer was operated through the transitions from the precursor to the product ions (m/z [mass-to-charge ratio] 355, 369, 358, and 372 for PrA, PhA, PrA-IS, and PhA-IS, respectively). The retention times of PrA, PhA, PrA-IS, and PhA-IS were 19.33, 20.39, 19.31, and 20.38 minutes in a 26.83-minute analysis, respectively. Linearity, recovery, precision, and carry-over were evaluated to validate the method. The GC-MS method yielded a linear response from 0.032 to 9.951 μmol/L for PrA (R2=0.9999) and from 0.127 to 39.432 μmol/L for PhA (R2=0.9998). The limits of quantification by the methods were 0.032 μmol/L for PrA and 0.127 μmol/L for PhA. The recovery of PrA and PhA GC-MS method measurements were within ±10% when evaluated with external quality assessment materials. The within-batch and total coefficients of variation were all below 6% for both PrA and PhA test results. Twenty-interday imprecision (%) were all below 5% for both PrA and PhA test results. Carry-over was found to be 0.001% for PrA and –0.008% for PhA. The GC-MS PrA and PhA assay showed adequate recovery, precision, sensitivity, and linearity. Hence, it is suitable for routine clinical work.

Keywords: Pristanic acid, Phytanic acid, Gas chromatography-mass spectrometry, Method validation

페록시좀 질환(peroxisomal disorders) 환자들은 프리스탄산(pristanic acid) 및 피탄산(phytanic acid) 등과 같은 분지 사슬 지방산(branched-chain fatty acids)의 충분한 섭취가 이루어지면 혈장 프리스탄산 및 피탄산 농도가 증가한다[1]. 혈장 프리스탄산 및 피탄산의 신뢰할 수 있는 정량화는 페록시좀 질환 환자를 평가하는 데 필수적이다. 이에 저자들은 혈장 검체에서 프리스탄산 및 피탄산을 정량화하기 위한 기체 크로마토그래피 질량분석법(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 검사법을 구현하고 검증했다[1].

20 µM 2H3-프리스탄산 및 80 µM 2H3-피탄산(Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA)을 내부표준물질로 분석하여 GC-MS 검사법을 개발했다. 검체 전처리에는 아세토니트릴(acetonitrile)을 혼합한 HCl을 이용한 산 가수분해 및 메탄올(methanol)을 혼합한 NaOH를 이용한 알칼리 가수분해, 헥산(hexane)을 이용한 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction), 유기 용매의 증발, N-Methyl-N-tert-butyldimethylsilyltrifluoroacetamide (MTBSTFA) 및 피리딘(pyridine)에 의한 유도체화가 포함되었다. 길이 30 m, 내경(inner diameter) 0.25 mm, 필름 두께 0.25 µm인 HP-5MS (Agilent, Folsom, CA, USA) 컬럼이 장착된 7890B-5977B GC-MS (Agilent, Waldbronn, Germany) 장비를 사용하였고, 헬륨은 운반가스로 사용되었다. 질량분석기는 전구체(precursor)에서 생성물 이온(product ions)으로의 전이(transition)를 통해 구동되었다. 프리스탄산, 피탄산, 프리스탄산-내부표준물질 및 피탄산-내부표준물질 각각의 mass-to-charge ratio (m/z)은 다음과 같다(m/z: 355, 369, 358, 372). 프리스탄산, 피탄산, 프리스탄산-내부표준물질 및 피탄산-내부표준물질의 각각의 머무름 시간(retention times)은 다음과 같다(전체 26.83분 분석에서 각각 19.33, 20.39, 19.31, 20.38분).

분석장비 조건은 Table 1 (GC 조건), Table 2 (MS 조건)에 제시한 바와 같다. 본 연구에서는 검사법을 평가하기 위해 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)에 제시된 평가지침 및 문헌에 따라 GC-MS법을 이용하여 측정한 혈장 프리스탄산 및 피탄산 농도에 대하여 정밀도, 직선성, 회수율 및 잔효를 평가하였다[2-9]. 각각의 평가에 대한 통계는 Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA) 프로그램을 이용하여 분석하였다.

Table 1 . Analytical instrument conditions for gas chromatography.

VariableValues/features
Columns
Run time (min)26.83
Flow (mL/min)1
Pressure (psi)8.20
Average velocity (cm/sec)36.62
Holdup time (min)1.37
Post run (mL/min)1.30
Front injector
Syringe size (μL)10.00
Injection volume (μL)1.50
Plunger speedFast
Wash vial solventHexane
Inlets
Carrier gas controlConstant flow–helium
ModeSplit
Split ratio10:1
Split flow (mL/min)10
Oven program
Initial temperature60℃ for 1.00 min
Ramp 130℃/min to 160℃, hold for 0.00 min
Ramp 25℃/min to 230℃, hold for 0.00 min
Ramp 320℃/min to 230℃, hold for 5.00 min
Post run300℃


Table 2 . Analytical instrument conditions for mass spectrometry.

VariableValues/features
Ion modeElectron ionization
Source temperature (℃)250
Quadrupole temperature (℃)150
Electron energy (eV)70
Emission (µA)34.60
Repeller (V)31.11
Entrance lens (V)17.60
Extractor lens (V)0.00


정밀도는 ERNDIM Control Special Assays in Serum(물질번호 SAS2019.01, SAS2019.04, SAS2019.05, SAS-02.1 [lot. no. 2018.2161], SAS-02.2 [lot. no. 2018.2162]; MCA Laboratory, Winterswijk, Netherlands) 세 가지 각각 다른 농도의 외부정도관리물질을 이용하여 1일 1시행(run)씩, 시행당 3회, 3일 동안, 그리고 추가적으로 1일 3시행씩, 시행당 1회, 20일 동안 반복 측정하여 두 번에 걸쳐 평가하였다. 20일 추가정밀도 평가의 경우, 각각의 정도관리물질을 20일 동안 매일 3시행씩, 시행당 1회씩 반복 측정하여 평가하였다[2,3]. 정밀도의 허용기준은 <±15%로 설정하였다[4].

직선성은 CLSI EP06-A에 따라 평가하였다[5]. 프리스탄산 및 피탄산 표준품(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 톨루엔(toluene)으로 희석하여 검량선(calibration curve) 시료를 제조하는 방법과 동일한 방법으로 직선성을 확인할 수 있는 농도의 물질을 조제하였다. 이들을 각각 3회씩 반복 측정하여 그 결과를 이용하여 직선성을 평가하였다.

회수율은 ERNDIM Control Special Assays in Serum(물질번호 SAS2019.01, SAS2019.04, SAS2019.05; MCA Laboratory, Winterswijk, Netherlands) 세 가지의 각각 다른 농도의 외부정도관리물질을 이용하여 1일 3회, 3일간 분석하여 평가하였다[6].

잔효는 [(L1–L3)/(H2–L3)]×100 계산식으로 구하여 평가하였고, 허용기준은 <±1.0%로 설정하였다[7-9]. 프리스탄산 및 피탄산의 잔효는 각각 0.001%, –0.008%로 허용기준을 만족하였다.

각 종목별 정밀도 평가결과를 Table 3에 제시하였다. 각 종목별 정밀도 평가결과 총 변이계수는 2.60%에서 4.58% 수준의 값을 보였다[4]. Fig. 1은 프리스탄산 및 피탄산 검사항목의 직선성 평가결과를 보여주는 그래프이다. 직선성 평가에서 두 종목 모두 결정계수가 0.99 이상이었다. 각 종목별 회수율 평가결과를 Table 4에 제시하였다. 각 종목별 회수율 평가결과 회수율은 92.30%에서 109.09% 수준의 값을 보였다[4].

Table 3 . Precision of pristanic acid and phytanic acid measurements by gas chromatography-mass spectrometry with high-, medium-, and low-level quality control materials.

ItemsLevel (μmol/L)Mean±standard deviation (μmol/L)Coefficient of variation (%)
Pristanic acidLow0.63±0.022.60
Medium1.27±0.054.24
High3.70±0.153.97
Phytanic acidLow2.58±0.072.87
Medium5.33±0.244.58
High13.76±0.443.20


Table 4 . Recovery of pristanic acid and phytanic acid measurements by gas chromatography-mass spectrometry with high-, medium-, and low-level quality control materials.

ItemsAssigned (μmol/L)Mean±standard deviation (μmol/L)Coefficient of variation (%)Recovery (%)
Pristanic acid0.440.48±0.023.29109.09
2.152.23±0.062.63103.91
6.206.38±0.233.73102.90
Phytanic acid3.483.43±0.123.4398.51
9.509.39±0.111.1298.85
15.7014.49±0.281.9092.30


Figure 1. Linearity analyses by gas chromatography-mass spectrometry method measurements. (A) Pristanic acid. (B) Phytanic acid.

GC-MS법을 이용한 혈장 프리스탄산 및 피탄산의 농도 측정은 정밀도, 직선성, 회수율, 잔효에 있어서 매우 만족할 만한 결과를 보였다. 따라서 혈장 프리스탄산 및 피탄산 GC-MS 검사법은 연구목적뿐 아니라 임상검사 목적으로도 유용하게 사용할 수 있을 것으로 판단된다.

  1. Vreken P, van Lint AE, Bootsma AH, Overmars H, Wanders RJ, van Gennip AH. Rapid stable isotope dilution analysis of very-long-chain fatty acids, pristanic acid and phytanic acid using gas chromatography-electron impact mass spectrometry. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1998;713:281-7.
    CrossRef
  2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of precision of quantitative measurement procedures: EP05-A3. 3rd ed. Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014; 2014.
  3. Whang DH. Method validation: precision. 6th ed. Seoul: PanMun Education; 2021. p. 73-6.
  4. U.S. Department of Health and Human Services; Food and Drug Administrations; Center for Drug Evaluation and Research; Center for Veterinary Medicine. Bioanalytical method validation: guidance for industry. Silver Spring (MD): Center for Drug Evaluation and Research, Food and Drug Administrations; 2018.
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures: a statistical approach: EP06-A. Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute; 2003.
  6. Clinical and Laboratory Standards Institute. User verification of precision and estimation of bias; approved guideline: EP15-A3. 3rd ed. Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014.
  7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Preliminary evaluation of quantitative clinical laboratory measurement procedures; approved guideline: EP10-A3-AMD. 3rd ed. Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute; 2014.
  8. Haeckel R. Recommendations for definition and determination of carry-over effects. J Automat Chem 1988;10:181-3.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  9. Broughton PM. Carry-over in automatic analysers. J Automat Chem 1984;6:94-5.
    Pubmed KoreaMed CrossRef

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