정상세포에서 악성 종양세포로 변화하는 과정은 세포 성장 및 생존에 유리한 여러 체성 변이를 차례차례 획득하면서 발생하게 된다[1,2]. 종양의 체성 변이를 확인하는 것은 그 종양의 성질을 더 깊게 이해할 수 있게 하고, 치료를 최적화하거나 새로운 치료방법을 고안할 수 있게 하기 때문에, 최근 암 치료에서 분자기법을 이용한 돌연변이 검출이 매우 중요하게 여겨지고 있다. 전통적으로 종양의 유전적 검사에는 조직생검을 통해 얻은 종양조직이 가장 많이 쓰여 왔으나, 최근 발전한 액체생검은 혈액이나 체액 내의 순환종양 유래 성분을 미침습적 또는 최소 침습적으로 검출할 수 있는 기술로, 종양치료의 큰 변화 가능성을 가져오고 있다[3]. 액체생검의 대상이 될 수 있는 성분으로는 순환종양 유래세포(circulating tumor cells), 순환종양 유래 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA), 각종 단백질 및 대사산물 등 여러 종류가 있으며, 최근 액체생검을 이용한 세포 유래 DNA (cell free DNA, cfDNA) 검출기술 및 차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS)의 발달로 단일 유전자 및 다중 유전자의 변이를 검출하여 cfDNA 중 종양으로부터 유래한 ctDNA의 특성을 파악할 수 있다[4]. 이러한 ctDNA는 원발종양의 유전적인 정보를 담고 있으므로 종양의 진단, 추적관찰, 예후예측 등에 유용한 정보를 제공할 수 있고, 최근 여러 ctDNA를 이용한 액체생검검사가 동반진단의 형태로 종양에 대한 표적치료 약제와 연계되어 진료현장에 도입되어 사용되고 있다[4].

혈중 존재하는 대부분의 cfDNA는 혈액 내의 혈구로부터 유리되며, 종양에서 유래하는 ctDNA의 분율은 매우 다양하며 1% 미만인 경우도 빈번하므로 높은 검출 민감도를 요구한다. 혈장으로부터 유리 DNA를 추출해내는 분석 전 단계에서부터 데이터를 분석하는 생물정보학적 과정에 이르는 검사의 전 과정이 적절히 이루어져야 ctDNA 검사의 신뢰성을 확보할 수 있으므로, 검체 전처리에서 검사결과의 판독 모두를 평가과정에 포함할 수 있는 적절한 외부정도관리 프로그램이 시행되어야 한다. 본 연구에서는 NGS 기반 액체생검검사를 위한 외부정도관리 프로그램의 원활한 운영을 위하여 대량으로 확보가 가능한 세포주를 재료로 하여 외부정도관리물질을 만드는 방법을 고안하고자 하였다.

1. 세포주 선정 및 변이 확인

미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration)에서 승인된 종양 표적치료제 및 그와 동반 진단으로 연계된 바이오마커 목록을 참고하여[5], 임상적으로 중요한 체성 변이들을 선정하였다. 선정된 변이의 정보를 COSMIC 데이터베이스에서 재확인한 뒤 실험에 사용할 체성 변이의 종류를 최종 확정하였다[6]. 해당 변이들을 포함하고 있는 세포주 7종류를 RPMI 1640 media에 소태아혈청을 첨가한 배지에 배양하였다. 배양한 세포로부터 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출된 세포주 유래 genomic DNA에 대하여 MiSeq Dx (Illumina, San Diego, CA, USA)와 target enrichment kit (Pan100; Dxome, Seongnam, Korea)를 이용한 NGS 기반 유전성 종양 유전자 패널검사를 각각 시행하여 각 세포주별로 검출된 변이의 종류와 그 위치를 확인하였다.

2. 액체생검 NGS 외부정도관리물질 제조

앞서 추출한 각 세포주의 genomic DNA를 변이의 조합을 고려하여 2종류의 변이 조합을 구성하였다. 1종의 검체에는 3종의 세포주 유래 DNA를 각 500 ng씩, 다른 1종의 검체에는 5종의 세포주 유래 DNA를 각 300 ng씩 혼합하였다. 혼합한 DNA 1,500 ng을 증류수에 희석한 뒤 ultrasonicator (ME220 Focused-ultrasonicator; Covaris Inc., Woburn, MA, USA)에서 160초간 shearing하였다. Shearing된 DNA의 평균 크기를 TapeStation 4200 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 이용해 측정하여 DNA의 분절화가 잘 이루어졌는지 확인하였다. 신선동결 혈장에 분절화된 DNA를 첨가하여 spiking하고, 혼합하여 균질화한 뒤 각각 소분하여 –70℃에 냉동시켜 외부정도관리 배포용 물질을 제조하였다.

3. 변이 검출 여부 확인

제조한 외부정도관리 배포용 물질으로부터 Dxseq Magnetic Circulating DNA Maxi Reagent (Dxome)를 이용하여 cfDNA를 추출하였다. 추출된 cfDNA를 Library Prep Reagent for illumina (cfDNA, Dxome)을 사용하여 library preparation을 시행하였다. 이를 NextSeq Dx (Illumina)를 이용하여 cell-free DNA gene panel (Pan100) 검사를 시행하였다. 검사결과로 얻은 데이터를 Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)과 Integrative Genomics Viewer (Broad Institute and the Regents of the University of California, https://software.broadinstitute.org/software/igv/home)를 이용해 분석하여 의도한 변이가 정상적으로 검출되는지 확인하였다. 각각의 변이 위치에서 검체에 포함된 세포주의 variant allele frequency (VAF)의 평균을 구하여 각 검체의 예상되는 VAF 값을 구하고, 이를 실제 검사 및 분석결과와 비교하였다(Fig. 1).

Figure 1. Schematic diagram of external quality assessment (EQA) material preparation method. Abbreviation: NGS, next-generation sequencing.

1. 세포주 선정 및 변이 확인

실험대상으로 선정한 대표적인 변이와, 각 세포주별 변이의 유무는 Table 1과 같았다.

Table 1 . List of selected variants detected in cell lines used in the study

Gene	Position by hg19	Accession no.	Variant description	Amino acid change	Cell lines (VAF%)
					A	B	C	D	E	F	G	H
BRAF	7:140453136	NM_004333.4	c.1799T>A	p.Val600Glu	P (99.6)	N	N	N	N	N	P (13.4)	N
EGFR	7:55242465	NM_005228.5	c.2235_2249del	p.Glu746_Ala750del	N	N	P (74.0)	N	N	N	N	N
EGFR	7:55249071	NM_005228.5	c.2369C>T	p.Thr790Met	N	N	N	N	N	P (77.0)	N	N
EGFR	7:55259515	NM_005228.5	c.2573T>G	p.Leu858Arg	N	N	N	P (91.7)	N	P (72.7)	N	N
KIT	4:55570011	NM_000222.2	c.878A>G	p.Asn293Ser	N	N	P (51.6)	N	N	N	N	N
KRAS	12:25398285	NM_004985.5	c.34G>A	p.Gly12Ser	N	P (99.5)	N	N	N	N	N	N
PALB2	16:23646191	NM_024675.3	c.1676A>G	p.Gln559Arg	P (99.7)	N	N	N	P (67.1)	N	N	N
PIK3CA	3:178917478	NM_006218.4	c.353G>A	p.Gly118Asp	N	N	N	N	N	P (60.9)	N	N
TP53	17:7577538	NM_000546.5	c.743G>A	p.Arg248Gln	N	N	P (100.0)	N	P (100.0)	N	N	N
TP53	17:7578290	NM_000546.5	c.560-1G>A	p.?	N	N	N	P (100.0)	N	N	N	N

Abbreviations: VAF, variant allele frequency; P, positive; N, negative.

2. 액체생검 NGS 외부정도관리물질 제조

변이의 조합을 고려하여 여러 세포주 유래 DNA를 조합하여 2종의 DNA 혼합물을 제조하였다. Sonication 처리 후 DNA 혼합물의 평균 DNA 크기는 각각 203 bp/201 bp로 나타났다(Fig. 2). 분절화된 DNA를 신선동결 혈장에 첨가하고 균질화 과정을 거친 뒤, 1 vial당 100 ng의 분절화된 DNA를 함유한 5 mL의 검체로 소분하여 –70℃에 냉동시켜 외부정도관리물질을 제조하였다.

Figure 2. Changes of DNA fragment size distribution after ultrasonication. (A) Size distribution of genomic DNA before ultrasonication. (B) Size distribution of fragmented DNA after ultrasonication. Abbreviation: FU, follow-up.

3. 변이 검출 여부 확인

제조한 외부정도관리물질 2종에 대하여 각각 targeted NGS panel 검사를 시행하였다. 검사결과 Table 2와 같이 각각의 외부정도관리물질이 서로 다른 변이 조합을 가지며, Fig. 3과 같이 체성 변이가 검출되는 것을 확인하였다.

Table 2 . Examples of liquid biopsy next-generation sequencing test results of the manufactured external quality assessment material

Gene	Position by hg19	Accession no.	Variant description	Amino acid change	Specimen 1				Specimen 2
					Detection	VAF (%)	Estimated VAF (%)		Detection	VAF (%)	Estimated VAF (%)
BRAF	7:140453136	NM_004333.4	c.1799T>A	p.Val600Glu	N		0		P	16.94	22.60
EGFR	7:55242465	NM_005228.5	c.2235_2249del	p.Glu746_Ala750del	P	11.45	24.67		N		0
EGFR	7:55249071	NM_005228.5	c.2369C>T	p.Thr790Met	N		0		P	5.30	17.95
EGFR	7:55259515	NM_005228.5	c.2573T>G	p.Leu858Arg	P	61.38	30.58		P	4.82	14.54
KIT	4:55570011	NM_000222.2	c.878A>G	p.Asn293Ser	P	7.76	17.19		N		0
KRAS	12:25398285	NM_004985.5	c.34G>A	p.Gly12Ser	N		0		P	15.92	19.91
PALB2	16:23646191	NM_024675.3	c.1676A>G	p.Gln559Arg	P	11.27	22.36		P	17.48	19.93
PIK3CA	3:178917478	NM_006218.4	c.353G>A	p.Gly118Asp	N		0		P	17.27	13.85
TP53	17:7577538	NM_000546.5	c.743G>A	p.Arg248Gln	P	23.29	66.67		N		0
TP53	17:7578290	NM_000546.5	c.560-1G>A	p.?	P	25.65	33.33		N		0

Abbreviations: VAF, variant allele frequency; N, negative; P, positive.

Figure 3. Somatic variants observed in manufactured external quality assessment materials, visualized with Integrative Genome Viewer (IGV). (A) NM_005228.5 (EGFR):c.2235_2249del. (B) NM_004333.6 (BRAF):c.1799T>A.

임상적으로 사용되는 NGS 검사의 절차는 일반적으로 검체 전처리 과정과 핵산 추출, library preparation, 검체 정량 및 pooling, NGS 장비를 이용한 시퀀싱, 생물정보학적 분석, 그리고 판독자의 변이 검토, 해석 및 보고로 이루어져 있다[7]. 검사의 질 관리를 위해서는 이러한 일련의 과정을 모두 평가할 수 있는 외부정도관리 프로그램이 필요하다.

NGS 검사의 외부정도관리물질로 사용될 수 있는 것에는 환자의 전혈 또는 genomic DNA, 세포주 유래 DNA, 합성 DNA 및 전자 데이터 등이 있으며, 많은 NGS 검사 수행능 평가에서 세포주 유래 genomic DNA를 발송하고 있다[8]. cfDNA는 주로 세포의 apoptosis 과정에서 혈중으로 방출되는데, 그 길이의 분포가 mononucleosome의 길이(대략 167 bp)에서 최고점을 보이고, dinucleosome 및 trinucleosome에서 다시 peak를 보이나, 그 정도가 점점 감소하는 형태의 ladder-like distribution을 보인다. 또한 정상 cfDNA에 비하여 종양세포에서 유래한 ctDNA는 30 bp가량 짧은 길이에서 가장 많은 분포를 보이는 것으로 보고된 바 있다[9]. 따라서 ctDNA NGS 검사의 정도관리 검체의 경우, 대부분의 cfDNA가 짧은 길이의 fragment 상태로 존재하고 있는 임상 검체의 특성을 잘 반영한 물질이 사용되어야 한다. 이전 연구에서 세포주 유래 DNA와 ultrasonication을 이용한 cfDNA 표준물질의 제조방법이 보고된 바 있어[10], 본 연구에서도 길이가 긴 세포주 유래 genomic DNA를 비교적 짧은 길이인 실제 cfDNA와 유사한 조건으로 만들기 위하여 ultrasonication을 이용해 분절화하는 방법을 사용하여 cfDNA와 유사한 길이의 DNA fragment가 생성되는 것을 확인하였다.

혈장에 함유된 cfDNA 중, ctDNA의 분율은 환자의 임상 상황에 따라 다르지만 1% 이하로 매우 낮을 수 있으므로[11], ctDNA NGS 검사는 변이 검출에 있어서 매우 높은 민감도를 필요로 한다. 세포주 유래 DNA의 경우 매우 높은 VAF를 보이므로, ctDNA NGS 검사의 민감도를 평가하기에 부적절할 수 있다. 본 연구에서는 건강인의 혈장에 세포주 유래 DNA를 소량 spiking하는 방법으로 외부정도관리 배포용 물질을 제조하였다. 건강인의 혈장에도 혈구세포에서 유래한 cfDNA가 자연적으로 존재하기 때문에, 추가로 정상세포주 유래 DNA를 첨가하지 않아도 종양세포주 유래 DNA의 높은 VAF를 낮출 수 있었다. College of American Pathologists에서 실시한 cell-free tumor DNA proficiency test의 경우, synthetic plasma matrix에 DNA fragment를 추가한 0.1%–1.0% 범위의 VAF를 갖는 검체를 배포한 바 있다[12]. 본 연구에서 제조된 외부정도관리물질의 경우, 선택된 변이에 대하여 4.82%–61.38%의 VAF로 관찰되고 있어 다소 높은 경향을 보였다. 임상 ctDNA 검체와 유사하게 낮은 VAF를 갖는 외부정도관리 검체를 제조하려면, 검체 제조에 사용하는 건강인 혈장에 함유된 DNA의 양에 따라 첨가할 세포주 유래 DNA 양을 조절하는 등의 추가적인 노력이 필요하다.

본 연구에서 제시한 세포주 유래 DNA를 sonication하여 분절화한 뒤 건강인 유래 혈장에 혼합하여 ctDNA 외부정도관리물질을 제조하는 방법은 시판 표준물질을 구입하는 방법 대비 비용이 저렴하다는 장점이 있다. 또한 사용하는 세포주의 종류를 적절히 변경하여 매우 다양한 변이 조합의 외부정도관리물질을 제조할 수 있다는 점도 원활한 외부정도관리 프로그램 운영에 도움을 줄 수 있다.

세포주를 이용한 ctDNA NGS 검사 외부정도관리물질 제조 시 주의해야 할 사항이 존재한다. 먼저 알려진 세포주를 이용하더라도 각 세포주에 존재하는 변이를 사전에 확인한 후 사용하여야 한다. 세포주는 많은 양의 DNA를 안정적으로 공급할 수 있는 원천이 되지만, 세포주의 유지과정에서 clonal population이 발생하여 불균질한 유전적 특징을 가질 가능성을 배제할 수 없다[8]. 따라서 해당 변이를 갖는 것으로 알려진 세포주에서 유래한 DNA라 할지라도, VAF가 100%보다 낮을 수 있기 때문에 제조에 사용하기 전 변이 존재 여부 및 그 분율을 검사를 통하여 확인하여야 한다.

또 다른 한계점으로는, 조사하고자 하는 변이의 allele frequency를 정확하게 조절하기 어렵다는 점이 있다. 이전에 cfDNA 표준물질 제조방법을 기술한 연구의 경우, 정확한 VAF를 가진 표준물질을 제조하기 위하여 변이가 없는 세포주에서 유래한 DNA와 혼합하는 방식으로 제조하였다[10]. 그러나 이와 달리 본 연구에서는 정상세포주 유래 DNA 첨가 없이 공여받은 혈장에 자연적으로 존재하는 cfDNA가 종양에서 유래하지 않은 정상 cfDNA의 역할을 하도록 고안하였다. 그러나 cfDNA는 신체적•정신적 스트레스[13], 패혈증[14], 외상[15], 조직 손상[16] 등 종양 이외에도 다양한 상황에서 그 양이 변화할 수 있다. 같은 농도로 세포주 유래 DNA를 spiking하여도 공여받은 혈장에 존재하는 cfDNA의 양이 다를 수 있기 때문에 제조 시마다 다른 VAF를 보이게 된다. 본 연구결과에서, 선택된 변이에서 관찰된 VAF는 실제 검체에 포함된 세포주들의 VAF를 산술 평균한 값에 비하여 대체로 낮은 경향을 보였다. 이는 검체를 구성하는 공여자의 혈장에 포함된 자연적으로 포함된 혈구세포로부터 유래한 야생형의 cfDNA의 영향으로, 세포주 유래 cfDNA가 희석된 결과로 의도된 결과이다. 그러나 일부 변이의 경우, 예상되었던 VAF보다 높은 VAF로 검체에서 검출되었다. 검사에 사용한 Illumina NextSeq Dx 등 대부분의 NGS 기법은 PCR 기반의 amplification 과정을 포함한다[17]. 이러한 amplification 과정에서 특정 read의 extra copy가 존재하는 등 bias가 발생할 수 있으므로[18], 시퀀싱 된 read count 수가 실제 VAF와 일치하지 않을 수 있다. 따라서 검출 여부를 조사하고자 하는 변이가 적절한 VAF로 물질에서 검출되는지 배포하기 전에 반드시 사전에 확인하여야 한다.

본 연구에서는 비교적 쉽게 다량 확보할 수 있는 세포주 유래 DNA을 ultrasonication을 통해 분절화한 뒤 정상인 유래 혈장에 spiking하여 ctDNA 임상 검체와 유사한 조건의 외부정도관리 배포용 물질을 제조하는 방법을 제시하였다. 이러한 방법은 ctDNA NGS 검사의 질 관리를 위하여 필수불가결한 외부정도관리 프로그램의 원활한 운영에 도움이 되어, ctDNA NGS 검사의 정확성과 신뢰성을 향상시켜 종양 환자의 진료에 이바지할 수 있을 것으로 생각된다.

이 연구는 대한임상검사정도관리협회의 2021년 학술연구비 지원으로 수행되었다(과제번호: 2021-2).