유전 변이의 정확한 명명(nomenclature)은 유전질환의 진단을 위해 중요할 뿐만 아니라 임상유전체검사의 정도관리 및 표준화 측면에서 필수적이다. 부정확한 변이 명명으로 인해 병원성 변이(pathogenic variants)를 놓칠 수 있으며, 양성 변이(benign variants)를 잘못 선별하여 변이 해석의 오류를 초래할 수도 있다. 따라서 임상유전체검사 결과를 보고하거나 또는 유전 변이 데이터를 공유할 때 표준화된 변이 명명을 사용하는 것은 매우 중요하다.

Variant call format (VCF)은 차세대염기서열분석을 통해 생성한 유전 변이를 보관하는 파일형태 중 하나로, 다양한 유전 변이를 표현하는 표준 파일형식이다[1]. VCF에는 유전 변이의 위치(genomic position), reference allele, alternative allele 등의 정보가 포함되어 있어 이를 기반으로 유전 변이 명명이 이루어진다. 그런데 다중염기변이(multiple-nucleotide polymorphism)의 경우, 같은 변이라도 여러 방식으로 표현할 수 있기 때문에, 여러 VCF 파일을 비교하기 위해서는 표준화된 표현방식이 요청된다(Fig. 1). 여러 방식으로 표현될 수 있는 변이에 대해 트리밍(trimming)과 정렬(alignment) 과정을 적용하여 서로 비교 가능한 형태로 만드는 과정을 VCF 정규화(VCF normalization)라고 한다[2-4].

Figure 1. Example of different representations of the same variant. There are several ways for representation of c.5delGGC. The variant call format described in A is generated through the normalization.

최근 국내 임상유전체검사실의 생물정보학적분석 파이프라인에 대한 현황 조사결과에 따르면, 절반 이상의 검사실(52%, 12/23)에서는 VCF 정규화를 시행하지 않는다고 보고한 바 있다[5]. 또한 VCF 정규화를 시행하는 경우에는 Genome Analysis Toolkit (GATK) LeftAlignAndTrimVariants (LAATV)와 vt-normalize 툴킷을 이용하는 경우가 각각 13% (3/23), 22% (5/23)로 확인되었다[3-5]. GATK-LAAVT를 이용하는 정규화는 삽입/중복/결손에 대해서 왼쪽 정렬을 시행하는 과정과 중복염기서열에 대해 왼쪽과 오른쪽에서 트리밍을 시행하는 과정으로 구성되어 있다[3]. 또한 vt-normalize에 의한 정규화는 삽입/중복/결손에 대한 정렬과 양측 트리밍으로 구성된다는 점에서 GATK-LAAVT와 유사하지만, 복합형 변이에 대해서도 왼쪽 정렬을 시행한다는 점에서 차이가 있다[4].

본 연구에서는 VCF 정규화 시행 여부에 따라 유전 변이 명명의 정확도가 달라지는지 평가하고자 한다. 이를 통해 임상유전체검사실 분석파이프라인에 VCF 정규화 과정 도입의 필요성을 확인하고, 임상유전체검사의 정도관리 및 정확도 개선에 기여하고자 한다.

대한임상검사정도관리협회로부터 유전 변이(단일염기변이[n=51], 삽입/중복/결손[n=13]) 정보가 검증된 binary alignment map (2021년 신빙도조사 GNG-21-01, GNG-21-04; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 파일을 획득하여 Torrent Suite ver. 5.10 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 VCF 파일을 생성하였다. snpEff (v4_3_GRCh37.p13.RefSeq; http://pcingola.github.io/SnpEff/)를 이용하여 Human Genome Variation Society 권장사항에 따라 염기변이를 기술하였고, vt-normalize와 GATK LAATV (GATK ver. 4.1.2.0; Broad Institute, Cambridge, MA, USA)를 이용하여 VCF 정규화를 수행하였다[3,4,6]. 대한임상검사정도관리협회로부터 정보가 검증되지 않은 변이의 대립유전자 빈도가 15% 미만인 경우와 predicted mRNA 모델 기반으로 생성되는 경우는 변이 분석대상에서 제외하였다. 검증된 변이 64개에 대해 정규화를 시행하지 않고 생성한 변이 명명과 VCF 정규화 시행 후 생성한 변이 명명을 비교하여 정확도 차이가 있는지 비교하였다. 변이의 형태는 integrative genomics viewer (IGV)를 통해 시각적으로 확인하였다.

전체 937개의 변이(단일염기변이[n=822], 삽입/중복/결손[n=115])를 생성하였으며, VCF 정규화 과정을 통해 대략 1.0% (n=9/937) (vt-normalize 단독: 0.9% [8/937], GATK LAATV 단독: 0.9% [8/937], vt-normalize와 GATK LAATV: 0.7% [7/937])의 변이 명명이 달라지는 것을 확인하였다. 정규화 방법 차이(vt-normalize vs. GATK LAATV)로 인해 명명이 달라지는 변이는 2개로 확인되었다(Table 1).

Table 1 . Variant nomenclature changed based on the results of variant call format normalization.

Chr	Position	Ref	Alt	Gene	Transcript	Pre-normalization	GATK LAATV	vt-normalize	Validation
chr5	74021847	ACTCAAA	A	PYGL	NM_001281302.1	c.1921_1926delTTTGAG	c.1922_1927delTTGAGT	c.1922_1927delTTGAGT	No
chr14	51375699	TA	TAA	PIEZO1	NM_002863.4	c.2178-28dupT	c.2178-27dupT	c.2178-27dupT	No
chr16	88793089	CA	CG	PIEZO1	NM_001142864.2	c.3699+33T>C	c.3699+33T>C	c.3699+33_3699+ 34delTGinsCC	No
chr18	67863851	C	CTCC	RTTN	NM_173630.3	c.724_726dupGGA	c.725_727dupGAG	c.725_727dupGAG	Yes
chr2	179634391	TATT	TT	TTN	NM_001267550.1	c.8902+13_8902+ 14delAT	c.8902+28_8902+ 29delTA	c.8902+13_8902+ 14delAT	No
chr6	65016997	AGA	A	EYS	NM_001142800.1	c.6079-24_6079- 23delTC	c.6079-4_6079-3delTC	c.6079-4_6079-3delTC	No
chr6	70983674	ATAAA	A	COL9A1	NM_001851.4	c.1065+72_1065+ 75delTTTA	c.1065+102_1065+ 105delTATT	c.1065+102_1065+ 105delTATT	No
chr11	86658278	ACAA	A	FZD4	NM_012193.3	c.*3903_*3905delTTG	c.*3908_*3910delGTT	c.*3908_*3910delGTT	No
chrX	31165667	AAAAGAAAGAA	AAAAGAA	DMD	NM_004006.2	c.10554-42_10554- 39delTTCT	c.10554-36_10554- 33delCTTT	c.10554-36_10554- 33delCTTT	No

Abbreviations: Chr, chromosome; Ref, reference allele; Alt, alternative allele; GATK, Genome Analysis Toolkit; LAATV, LeftAlignAndTrimVariants..

검증된 64개의 변이만을 대상으로 분석했을 때, 정규화 시행 전 생성된 변이 명명의 오류는 1.6% (1/64: 단일염기변이[n=0/51], 삽입/중복/결손[n=1/13])로 확인되었다. 정규화 시행 전 변이 명명에서 오류를 보인 변이 NM_173630.3(RTTN): c.724_726dupGGA는 정규화 작업을 통해 NM_173630.3(RTTN): c.725_727 dupGAG로 교정되었다(Table 1). 이 변이는 IGV를 통해 직접 확인했을 때 NM_173630.3(RTTN): c.725_727dupGAG로 명명되었다. 64개의 검증된 변이 명명에서 정규화 방법(vt-normalize vs. GATK LAATV)에 따른 차이는 관찰되지 않았다.

본 연구에서는 VCF 정규화의 필요성을 확인하기 위해 vt-normalize와 GATK LAATV를 이용하여 VCF 정규화를 시행하여 변이 명명에 미치는 영향을 평가하였다[3,4]. VCF 정규화 과정의 적용을 통해 명명의 차이가 발생하는 변이의 비율은 상대적으로 낮지만, 정규화 시행 전 오류를 보였던 변이 명명이 정규화 적용을 통해 정확하게 교정된 결과는 주목할 만하다. VCF 정규화는 정확한 변이 명명을 생성하기 위한 과정이 아님에도 불구하고, 여러 방식으로 표현될 수 있는 변이의 명명을 하나의 방식으로 표현하는 공통된 알고리즘 적용을 통해 변이의 정확한 명명에 기여하는 것으로 추정된다.

정규화 방법의 차이에 따라 명명이 달라지는 변이의 빈도는 1.0% (n=9/937)로 확인되었다. 또한 검증된 64개의 변이만을 대상으로 분석했을 때 정규화 방법(vt-normalize vs. GATK LAATV)에 따른 차이는 없었다. 기존 연구에 따르면 vt-normalize를 통해 정규화되는 삽입/중복/결손의 빈도는 GATK LAATV보다 3.4% 더 많은 것으로 보고된 바 있다[2]. 본 연구에서는 대상 변이의 개수가 적을 뿐만 아니라 정규화 효과(effectiveness)를 평가하여 방법에 따른 불일치(disagreement)의 정도를 비교한 것이 아니므로, 본 연구결과와 기존 연구결과의 직접적인 빈도 비교는 적절하지 않을 것으로 판단된다.

본 연구는 VCF 정규화 작업이 변이 명명의 정확도에 미치는 영향을 평가하기 위한 대상 변이의 개수가 64개에 불과하다는 점에서 한계가 있다. 또한 다양한 단일염기변이와 삽입/중복/결손을 포함하였음에도 불구하고 horizontally complex variant와 vertically complex variant와 같은 복합형 변이의 명명에 대해서는 평가하지 못했다. 삽입/중복/결손에 대해서만 정렬과정을 시행하는 GATK-LAAVT와 달리 vt-normalize는 복합형 변이에 대해서도 정렬시키는 과정이 포함되어 있으므로 추후에는 복합형 변이를 포함하여 vt-normalize와 GATK LAATV의 성능 차이를 비교하는 연구가 필요하다[3,4].

그럼에도 불구하고 본 연구는 국내 임상유전체검사실의 절반 이상에서 수행하지 않는 VCF 정규화 도입의 필요성을 제안하는 근거 자료를 생성했다는 점에서 의의가 있다. VCF 정규화 과정을 통해 정확한 변이 명명을 보장할 수 있는 것은 아니라는 사실 또한 주지할 필요가 있다. 정확한 변이 명명을 제공하기 위해서는 VCF 정규화 과정과 별도로 IGV를 통한 변이의 형태 확인하고, Mutalyzer (https://mutalyzer.nl/), VariantValidator (https://variantvalidator.org/), 또는 VarSome (https://varsome.com/) 등을 통해 변이 명명을 재확인하는 과정이 생략되어서는 안 된다. 추후 VCF 정규화 과정의 최적화 및 도입을 통해 Sanger 염기서열분석을 통한 변이 검증의 비용을 절감하면서도 임상유전체검사의 정도관리 및 정확도 개선에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

이 연구는 대한임상검사정도관리협회의 2022년도 학술연구과제 연구비 지원으로 수행되었다(과제번호: 2022-06).