보건복지부와 중앙암등록본부 국가암등록사업 연례보고서(2019년 암등록통계)에 따르면 2019년도 기준으로 여성에서 전체 암 발생 중 유방암 발생이 1위를 차지하였으며 여성에서 발생한 전체 암 중 20.6%(발생자 수 24,820명)로 나타났고, 유방암의 발생률은 최근 10여 년간 증가하는 추세를 보이고 있다. 난소암 발생은 여성 전체 암 중 2.6%(발생자 수 2,888명)로 나타났고, 사망률은 여성암 중 가장 높으며, 5년 상대생존율은 64.5%에 그쳤다[1].

유방암 환자 중 5%–10%, 난소암 환자 중 20%는 생식세포 유전자 이상에 의해 발생하며, 대부분은 유전자 이상과 관련 없이 발생한다[2]. 유전자 이상에 의해 발생한 유방암 및 난소암 환자에서 상당수의 유전자 변이는 가장 중요한 유방암 감수성 유전자로 알려져 있는 breast cancer susceptibility gene 1 (BRCA1)과 breast cancer susceptibility gene 2 (BRCA2)에서 일어난다[3]. BRCA1/2 유전자는 종양 발생을 억제하는 단백질을 만드는 유전자(tumor suppressor gene)이며 손상된 DNA를 복구하는 데 관여하여 유전체를 안정하게 유지하는 역할을 한다. BRCA1/2 유전자에 기능 상실 변이가 발생하면 이 유전자들이 코딩하는 단백질이 정상적으로 만들어지지 않고 손상된 DNA에서 올바른 복구가 일어나지 않게 되며 세포들은 추가적 유전적 변화가 일어나게 되어 암을 유발하게 된다[4]. BRCA1 돌연변이 발생 시 70세까지 유방암에 걸릴 누적 암 발생위험은 39%–87%이고, 난소암 누적 암 발생위험은 27%–45%이며, BRCA2 돌연변이 발생 시 유방암 누적 암 발생위험은 45%–84%, 난소암 누적 암 발생위험은 10%–20%로 알려져 있다[5-8].

손상된 DNA를 복구하는 것을 막는 약물인 poly ADP-ribose polymerase 억제제는 BRCA1 또는 BRCA2에 이상이 있는 암세포의 성장을 효과적으로 막아 유전성 유방암 및 난소암 환자에 대한 사용을 Food and Drug Administration (FDA)에서 승인받았고, 최근 2020년 3월에는 전이성 거세저항성 전립선암에 대해서도 FDA에서 승인을 받았다[9,10]. 이처럼 BRCA1/2는 진단 및 치료에 있어 중요한 생물표지자이다. 따라서 BRCA1/2 유전자검사를 통해, 위험에 따라 추가검사나 적절한 치료를 선택할 기회를 가지게 되고, 가족과 함께 암 위험을 관리할 수 있다.

BRCA1/2 유전자를 분석하기 위해 과거에는 Sanger 염기서열분석이 주로 사용되어 왔으나, BRCA1/2 유전자는 그 coding sequence 크기가 각각 5.6 kB, 10.2 kB로 비교적 크고 엑손(exon) 개수도 많아 Sanger 염기서열분석검사 시 많은 시간이 소요되며 노동집약적이다. 최근 다중유전자검사 및 대용량 분석이 강점인 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS)이 임상검사실에 도입됨에 따라 NGS는 BRCA1/2의 변이를 찾아내는 강력한 수단이 되었다. NGS는 부화(enrichment) 방법에 따라 앰플리콘(amplicon) 방법과 캡쳐(capture) 방법으로 나뉜다. 중합효소사슬반응(polymerase chain reaction, PCR) 시발체(primer)로 증폭을 하는 amplicon 방법은 비용 효과적이며, 짧은 준비시간, 상대적으로 적은 양의 DNA를 필요로 하기 때문에 적은 수의 유전자 패널에 대한 검사에 유용하다. 프로브(probe)로 교합하는 capture 방법은 프로브 사이의 간섭이 덜하여 많은 패널의 유전자 수가 많아지거나 엑솜 시퀀싱(exome sequencing)을 수행하는 데 유용하며, 염기서열 변화뿐 아니라 유전자 복제 수 변이(copy number variation, CNV) 검출 분석이 가능한 장점이 있다.

본 연구에서는 MiSeqDx (Illumina, San Diego, CA, USA) 장비를 이용한 타겟 캡쳐 방법의 유전자 검사키트 DxSeq BRCA1/2 (Dxome, Seongnam, Korea)를 사용해 BRCA1/2 유전자의 모든 엑손 및 주위 영역을 확인하여 유전성 돌연변이의 여부를 검사하고, 이 결과를 표준검사법인 Sanger 염기서열분석 결과와 비교하여 분석적 성능평가를 시행하였고, 국내 시판 허가된 다른 제조사의 앰플리콘 방법의 키트인 BRCAaccuTest (NGeneBio, Seoul, Korea)와 일치도를 비교하여 NGS 기반 BRCA1/2 유전자 검사키트의 성능을 검증하였다.

1. 대상

서울아산병원에서 2020년 1월부터 2020년 7월까지 BRCA1/2 유전자 검사가 의뢰되어 Sanger 염기서열분석 방법으로 검사된 검체 중, 적정량의 잔여 검체가 남아 있는 검체를 선택하고 익명화하여 개인식별정보가 노출되지 않게 서울아산병원의 개인식별코드로 대체하여 사용하였다. Sanger 염기서열분석 방법으로 BRCA1/2 변이가 확인된 59개의 검체와 유전자 CNV 양성 1개 검체, 그리고 임상적으로 유전성 유방/난소암 증후군 의심으로 BRCA1/2 검사가 의뢰된 검체이나 유의한 변이가 관찰되지 않은 음성인 84개 검체, 총 144개 검체를 선정하였다(Fig. 1).

Figure 1. Schematic flowchart of the study design. Abbreviations: BRCA1/2, breast cancer susceptibility gene 1/2; NGS, next-generation sequencing.

본 연구는 서울아산병원 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 심의 면제를 받았다(20201082).

2. DNA 추출

유전체 DNA 추출은 말초혈액에서 QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하였다. 모든 과정은 제조사의 지침에 따라 진행하였다. Proteinase K 20 µL, sample 200 µL, AL buffer 200 µL를 넣어 혼합한 후 56℃로 10분 incubation을 하였다. Ethanol 200 µL를 넣고 혼합 후 column에 넣고 8,000 rpm, 2분 centrifuge를 하였다. 새로운 collection tube에 옮겨 AW1 buffer 500 µL를 넣어 8,000 rpm, 2분 centrifuge를 하였다. AW2 buffer 500 µL를 넣어 14,000 rpm, 3분 centrifuge를 하였다. 마지막으로 14,000 rpm, 3분 centrifuge를 하여 남아있는 ethanol을 제거하였다. Column을 새로운 tube에 옮겨 AE buffer 50 µL를 넣어 실온에 20분 incubation을 한 뒤 8,000 rpm으로 1분 centrifuge를 하여 최종 산물을 취하였다.

3. 캡쳐 방법의 차세대 염기서열분석

캡쳐 방법(target capture method)의 NGS에는 유전자 검사키트 DxSeq BRCA1/2 (Dxome)가 사용되었으며, MiSeqDx 기기(Illumina Inc.)를 이용하였고, 모든 과정은 제조사의 지침에 따라 검사하였다. 과정을 간단히 기술하면, 추출한 DNA를 Covaris ME 2200 (Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 절편화하고 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)으로 확인하였다. 절편화된 DNA를 end repair and A-tailing, adapter ligation, post-ligation cleanup 후 생성된 adaptor-ligated library에 index sequence를 붙여 300–400 bp 크기의 index-tagged library를 만들고, 이를 같은 농도로 pooling 및 농축, 건조한 후 hybridization을 진행하였다. Hybridization 후 streptavidin beads를 결합시킨 on-bead captured DNA를 증폭, 정제하여 얻은 hybrid captured DNA library 검체를 200–700 bp, 4 nM로 크기와 농도를 확인한 후, NaOH 및 buffer를 이용하여 10 pM pool DNA로 만들어 Miseq reagent kit v2 (300 cycles)에 분주한 뒤 MiseqDX (Illumina Inc.) 장비를 통해 sequencing을 진행하였다.

4. 엠플리콘 방법의 차세대 염기서열분석

엠플리콘 방법(amplicon method)의 NGS에는 Sanger 염기서열 검사에서 변이가 관찰된 46개의 양성 검체를 대상으로 진행되었고, BRCAaccuTest (NGeneBio)를 사용하였고, MiseqDx 기기(Illumina Inc.)를 이용하였다. 모든 과정은 제조사 지침에 따라 진행하였다. 간단히 기술하면 추출한 DNA의 타겟 BRCA1/2 유전자 증폭 후 amplicon을 혼합, adapter ligation 후 생성된 library를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 adapter ligated library를 Miseq reagent kit v2 (300 cycles)를 사용하여 MiseqDX (Illumina Inc.) 장비로 sequencing을 진행하였다.

5. 생물정보학적 분석

MiseqDx에서 얻은 염기서열 검사결과를 장비 내장 소프트웨어인 Miseq Reporter (Illumina Inc.)를 사용하여 demultiplexing 후 FASTQ 파일로 변환하였다. 이 FASTQ 파일을 DxSeq NGS Gene Analysis System (Dxome)을 이용하여 데이터 분석을 시행하였다. DxSeq NGS Gene Analysis System에 포함된 세부 프로그램들과 작업과정은 다음과 같았다. 먼저 각 read를 BWA, Samtools를 사용하여 reference sequence (GRCh37 assembly)에 맞추어 alignment를 한 뒤, GATK MarkDuplicate를 이용하여 중복된 read를 제거하였다. 이후 indel이 있는 read를 GATK Realigner를 통해 재배열하였고, 재배열된 read의 base quality를 GATK BaseRecalibrator로 다시 계산하였다. 마지막으로 GATK PrintReads를 통해 read filtering 및 최종 bam 파일 생성을 시행하였다. 이후 GATK HaplotypeCaller를 이용해 single nucleotide polymorphism과 indel 검출을 시행하여 vcf 파일을 생성하고, DxSeq software ver. 1.0.1 (Dxome)을 사용하여 검출된 변이에 관련 정보를 annotation하였다. 모든 변이는 Human Genome Variation Society 가이드라인 ver. 20.05 (https://www.hgvs.org/content/guidelines)에 따라 기술하였고, reference transcript sequence로 BRCA1과 BRCA2에 대해 NM_007294.3과 NM_000059.3를 각각 사용하였다. 대상 변이는 Integrative Genomics Viewer (IGV)를 통해 확인하였다(http://software.broadinstitute.org/software/igv).

6. 통계분석

분석적 성능평가를 위해 Dxseq BRCA1/2 (Dxome)로 검사한 염기서열분석 결과와 기존에 알고 있던 Sanger 염기서열분석 결과를 비교하여 임상적 민감도, 특이도, 양성 예측도, 음성 예측도를 계산하였다. 통계분석방법에 따라 99.5%보다 큼을 확인하고 유의수준 5%일 때의 양측 95% 신뢰구간을 구하였다. 1차 유효성 평가방법은 기존의 확인된 Sanger 염기서열분석 결과가 음성인 검체가 시험키트 결과 음성으로 나오면 진음성으로, 양성으로 나오면 위양성으로 판정하였다. 또한 기존의 확인된 Sanger 검사결과가 양성인 검체가 시험키트 결과 음성으로 나오면 위음성이며 양성으로 나오면 진양성으로 판정하였다.

엠플리콘 방법의 NGS와 비교하여 평가하기 위해 프로브(probe)로 교합하는 캡쳐 방법의 키트인 Dxseq BRCA1/2로 검사된 평가결과와 앰플리콘 방법의 키트인 BRCAaccuTest로 검사된 평가결과를 비교하여 전체 일치도를 백분율로 분석하였다. 통계분석방법에 따라 유의수준 5%일 때의 양측 95% 신뢰구간을 구하였다.

Sanger 염기서열을 기존에 시행하였던 총 144개의 검체로 DxSeq BRCA1/2 키트(Dxome)를 이용하여 NGS 검사를 시행하였다. 144개 검체 모두에서 기존에 확인된 Sanger 염기서열 결과와 일치한 결과를 보였다(Table 1). 이는 각각 넌센스 변이(nonsense variant) 22개, 과오 변이(missense variant) 1개, 삽입/결실 변이(indel variant) 31개, 인트론 변이(intronic variant) 5개, 음성 84개였다(Fig. 2). Sanger 염기서열분석법에서는 변이가 관찰되지 않았던 한 검체에서 CNV 변이가 추가로 발견되었고, 이 CNV 변이는 multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA)을 통해 확인하였다. 염기서열분석에서 internal quality control 결과는 수용 가능한 결과를 보였으며 average depth의 평균은 418.1x(범위, 193.0x–799.4x)였다. 분류한 검사결과를 토대로 임상적 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도를 계산하였으며 각각 100%, 100%, 100% 그리고 100%이며 위양성, 위음성의 사례는 없었다.

Table 1 . Results of DxSeq and BRCAaccuTest next-generation sequencing panel from positive sample of Sanger sequencing

Test ID	Gene	Nucleotide change	AA change	Inter-pretation	Variant type	Dxome results (NT)	Dxome results (AA)	BRCAaccuTest results
D85	BRCA2	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	LP	Indel	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	Not tested
D86	BRCA1	c.4027_4051delinsTC	p.Asp1343Serfs*5	LP	Indel	c.4027_4051delinsTC	p.Asp1343Serfs*5	Not tested
D87	BRCA2	c.8186delA	p.Lys2729Argfs*4	LP	Indel	c.8186delA	p.Lys2729Argfs*4	Not tested
D88	BRCA2	c.8488-1G>A		P	Intronic	c.8488-1G>A		Not tested
D89	BRCA1	c.520C>T	p.Gln174*	LP	Nonsense	c.520C>T	p.Gln174*	Not tested
D90	BRCA2	c.8969G>A	p.Trp2990*	P	Nonsense	c.8969G>A	p.Trp2990*	Not tested
D91	BRCA2	c.4766delC	p.Pro1589Glnfs*28	LP	Indel	c.4766delC	p.Pro1589Glnfs*28	Not tested
D92	BRCA2	c.5351delA	p.Asn1784Thrfs*7	LP	Indel	c.5351delA	p.Asn1784Thrfs*7	Not tested
D93	BRCA2	c.8488-1G>A		P	Intronic	c.8488-1G>A		Not tested
D94	BRCA1	c.5496_5506del11insA	p.Val1833Serfs*7	LP	Indel	c.5496_5506del11insA	p.Val1833Serfs*7	Not tested
D95	BRCA2	c.7480C>T	p.Arg2494*	P	Nonsense	c.7480C>T	p.Arg2494*	Not tested
D96	BRCA1	c.302-2A>C		P	Intronic	c.302-2A>C		Not tested
D97	BRCA1	c.928C>T	p.Gln310*	P	Nonsense	c.928C>T	p.Gln310*	Concordance
D98	BRCA1	c.2830delT	p.Cys944Valfs*56	LP	Indel	c.2830delT	p.Cys944Valfs*56	Concordance
D99	BRCA1	c.2563C>T	p.Gln855*	P	Nonsense	c.2563C>T	p.Gln855*	Concordance
D100	BRCA2	c.3744_3747delTGAG	p.Ser1248Argfs*10	LP	Indel	c.3744_3747delTGAG	p.Ser1248Argfs*10	Concordance
D101	BRCA2	c.7480C>T	p.Arg2494*	P	Nonsense	c.7480C>T	p.Arg2494*	Concordance
D102	BRCA1	c.5509T>C	p.Trp1837Arg	VUS	Missense	c.5509T>C	p.Trp1837Arg	Concordance
D103	BRCA2	c.1399A>T	p.Lys467*	P	Nonsense	c.1399A>T	p.Lys467*	Concordance
D104	BRCA1	c.4065_4068delTCAA	p.Asn1355Lysfs*10	VUS	Indel	c.4065_4068delTCAA	p.Asn1355Lysfs*10	Concordance
D105	BRCA1	c.922_924delinsT	p.Ser308*	LP	Nonsense	c.922_924delinsT	p.Ser308*	Concordance
D106	BRCA1	c.1823delA	p.Lys608Argfs*4	LP	Indel	c.1823delA	p.Lys608Argfs*4	Concordance
D107	BRCA2	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	LP	Indel	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	Concordance
D108	BRCA2	c.7480C>T	p.Arg2494*	P	Nonsense	c.7480C>T	p.Arg2494*	Concordance
D109	BRCA2	c.1888dupA	p.Thr630Asnfs*6	LP	Indel	c.1888dupA	p.Thr630Asnfs*6	Concordance
D110	BRCA2	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	LP	Indel	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	Concordance
D111	BRCA2	c.1399A>T	p.Lys467*	P	Nonsense	c.1399A>T	p.Lys467*	Concordance
D112	BRCA1	c.5445G>A	p.Trp1815*	P	Nonsense	c.5445G>A	p.Trp1815*	Concordance
D113	BRCA1	c.5445G>A	p.Trp1815*	P	Nonsense	c.5445G>A	p.Trp1815*	Concordance
D114	BRCA2	c.2798_2799delCA	p.Thr933Argfs*2	LP	Indel	c.2798_2799delCA	p.Thr933Argfs*2	Not detected
D115	BRCA1	c.2281G>T	p.Glu761*	LP	Nonsense	c.2281G>T	p.Glu761*	Concordance
D116	BRCA1	c.(441+1_442-1)_ (4185+1_4186-1)del		VUS	CNV	Exon 8-12 deletion by CNV detection algorithm		Not detected
D117	BRCA1	c.3627dupA	p.Glu1210Argfs*9	VUS	Indel	c.3627dupA	p.Glu1210Argfs*9	Concordance
D118	BRCA2	c.1399A>T	p.Lys467*	P	Nonsense	c.1399A>T	p.Lys467*	Concordance
D119	BRCA1	c.81-9C>G		VUS	Intronic	c.81-9C>G		Concordance
D120	BRCA1	c.5496_5506delinsA	p.Val1833Serfs*7	LP	Indel	c.5496_5506delinsA	p.Val1833Serfs*7	Not tested
D121	BRCA2	c.1399A>T	p.Lys467*	P	Nonsense	c.1399A>T	p.Lys467*	Concordance
D122	BRCA1	c.1511dupG	p.Lys505*	LP	Nonsense	c.1511dupG	p.Lys505*	Concordance
D123	BRCA1	c.3627dupA	p.Glu1210Argfs*9	VUS	Indel	c.3627dupA	p.Glu1210Argfs*9	Concordance
D124	BRCA2	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	LP	Indel	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	Concordance
D125	BRCA1	c.5445G>A	p.Trp1815*	P	Nonsense	c.5445G>A	p.Trp1815*	Concordance
D126	BRCA1	c.911_918dup	p.Lys307Serfs*10	LP	Indel	c.911_918dup	p.Lys307Serfs*10	Not detected
D127	BRCA2	c.7480C>T	p.Arg2494*	P	Nonsense	c.7480C>T	p.Arg2494*	Concordance
D128	BRCA1	c.66dupA	p.Glu23Argfs*18	LP	Indel	c.66dupA	p.Glu23Argfs*18	Concordance
D129	BRCA2	c.7480C>T	p.Arg2494*	P	Nonsense	c.7480C>T	p.Arg2494*	Concordance
D130	BRCA1	c.4335_4338dup	p.Gln1447Argfs*16	LP	Indel	c.4335_4338dup	p.Gln1447Argfs*16	Concordance
D131	BRCA2	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	LP	Indel	c.9253delA	p.Thr3085Glnfs*19	Concordance
D132	BRCA2	c.6332dupA	p.Arg2112Glufs*17	LP	Indel	c.6332dupA	p.Arg2112Glufs*17	Concordance
D133	BRCA1	c.5467+1G>A		P	Intronic	c.5467+1G>A		Concordance
D134	BRCA1	c.2400_2402delinsTT	Lys800Asnfs*3	LP	Indel	c.2400_2402delinsTT	Lys800Asnfs*3	Concordance
D135	BRCA1	c.3982dupT	p.Ser1328Phefs*2	LP	Indel	c.3982dupT	p.Ser1328Phefs*2	Concordance
D136	BRCA2	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	LP	Indel	c.5576_5579delTTAA	p.Ile1859Lysfs*3	Concordance
D137	BRCA2	c.8732delC	p.Ala2911Glufs*16	LP	Indel	c.8732delC	p.Ala2911Glufs*16	Concordance
D138	BRCA2	c.8172_8175delGTGG	p.Trp2725Metfs*7	LP	Indel	c.8172_8175delGTGG	p.Trp2725Metfs*7	Not detected
D139	BRCA1	c.3442delG	p.Glu1148Argfs*7	LP	Indel	c.3442delG	p.Glu1148Argfs*7	Not detected
D140	BRCA1	c.390C>A	p.Tyr130*	VUS	Nonsense	c.390C>A	p.Tyr130*	Concordance
D141	BRCA1	c.5266C>T	p.Gln1756*	P	Nonsense	c.5266C>T	p.Gln1756*	Concordance
D142	BRCA2	c.4523dupG	p.Gln1509Thrfs*5	LP	Indel	c.4523dupG	p.Gln1509Thrfs*5	Concordance
D143	BRCA2	c.9076C>T	p.Gln3026*	P	Nonsense	c.9076C>T	p.Gln3026*	Concordance
D144	BRCA2	c.6553delG	p.Ala2185Leufs*6	LP	Indel	c.6553delG	p.Ala2185Leufs*6	Not tested

The instruments used were from the following companies: DxSeq BRCA1/2 (Dxome, Seongnam, Korea) and BRCAaccuTest (NGeneBio, Seoul, Korea).

Abbreviations: AA, amino acid; BRCA1, breast cancer susceptibility gene 1; BRCA2, breast cancer susceptibility gene 2; LP, likely pathogenic; NT, nucleotide; P, pathogenic; VUS, variant of uncertain significance; CNV, copy number variant.

Figure 2. Types of tested variants in BRCA1 and BRCA2. Abbreviations: BRCA1, breast cancer susceptibility gene 1; BRCA2, breast cancer susceptibility gene 2.

캡쳐 방법인 DxSeq BRCA1/2의 결과와 기존에 식품의약품안전처 허가를 받은 앰플리콘 방법의 NGS 검사인 BRCAaccuTest 키트를 이용한 검사결과와 비교하여 일치도를 산출하였다. 60개의 양성 검체 중 14개 검체는 잔여량 부족으로 제외되어 46개의 검체에 대해 BRCAaccuTest 키트로 검사하였고, 총 41개의 검체에서 일치한 결과를 보였으며 5개 검체에서는 해당 변이가 검출되지 않았다. 전체 일치율은 89.1%이며, 일치한 결과를 보인 41건은 넌센스변이(nonsense variant) 19개, 과오 변이(missense variant) 1개, 삽입/결실 변이(indel variant) 19개, 인트론 변이(intronic variant) 2개였다. 결과가 일치하지 않는 검체 5개는 위음성 사례였고, 4건은 indel variant이며 앰플리콘 방법의 NGS 검사결과에서는 검출되지 않았다(Fig. 3). 그 중 3건의 indel variant는 IGV에서 변이가 확인되지만 variant calling이 되지 않았고, 1건의 중복 변이는 IGV에서 변이 확인이 되지 않았다. 위음성 사례 중 나머지 1건은 5개 엑손 결실의 CNV이며 앰플리콘 방법의 NGS 검사법으로는 검출이 불가능하였다.

Figure 3. Visualization of discrepant variants from target capture and amplicon methods by Integrative Genomics Viewer. (A) NM_000059.3(BRCA2):c.2798_2799delCA from D114 sample. (B) NM_007294.3(BRCA1):c.911_918dup from D126 sample. (C) NM_000059.3(BRCA2):c.8172_8175delGTGG from D138 sample. (D) NM_007294.3(BRCA1):c.3442delG from D139 sample. The results marked with (*) are the results of DxSeq BRCA1/2 (Dxome, Seongnam, Korea), and the results marked with (_†) are the results of BRCAaccuTest (NGeneBio, Seoul, Korea). Abbreviations: BRCA1, breast cancer susceptibility gene 1; BRCA2, breast cancer susceptibility gene 2.

기존에 사용되던 Sanger 염기서열분석을 대체하여 NGS 검사법이 암을 포함한 여러 분야의 분자검사에 상용화되어 응용되고 있다. 지속적인 NGS 기술 발전으로 새로운 검사키트 개발이 많아지고 있으며 새로운 NGS 플랫폼들을 검증하고 성능을 비교하는 다수의 연구가 이루어지고 있다. 이번 연구에서는 target-capture 방법인 NGS 검사키트 DxSeq BRCA1/2를 사용하여 BRCA1/2의 검사결과를 Sanger 염기서열분석법 결과와 비교, 타사 앰플리콘 방법의 NGS 키트와 비교하여 임상적 성능을 검증하였다.

BRCA1/2 유전자의 경우, 종양억제유전자로 임상적 의미가 있는 변이들이 특정 hotspot에만 국한되지 않고 유전자 전장에 걸쳐서 분포하고 있다. 따라서 잘 고안된 BRCA 유전자 검사는 BRCA1/2 coding region 전체를 분석할 수 있어야 한다. 이를 검증하기 위하여, 본 연구에서는 검증에 이용할 검체를 선정할 시에 각 변이의 위치를 고려하여 BRCA1/2 유전자 전장에 걸쳐 있을 수 있도록 하였다. 변이의 종류 또한 indel variant 31개, 단일 염기변이(single nucleotide variant) 28개로 구성하였다. 이와 같은 검체 선정을 통해, 많은 수의 검체를 사용하지는 않았으나 DxSeq BRCA1/2가 BRCA 1/2 유전자 전장에 걸쳐 SNV 및 indel variant를 검출하는 성능이 양호함을 충분히 확인할 수 있었다.

DxSeq BRCA1/2를 사용한 NGS 결과와 표준검사법인 Sanger 염기서열분석 결과를 비교하여 임상적 성능을 평가하였다. 이 결과를 토대로 임상적 민감도와 특이도는 100%와 100%로, 기존의 Sanger 염기서열분석법 결과와 동일한 결과를 보여주었다. 또한 DxSeq software를 통해 annotation이 이루어진 결과를 보았을 때에도, Sanger 염기서열로 검출된 변이와 명명법상으로 모두 일치하고 있어, annotation tool의 성능도 임상적으로 사용하기에 적절하였다. 기타 다른 연구에도 NGS 결과는 Sanger 염기서열에 대해 동등한 결과를 얻었다는 보고가 있다[11-13].

캡쳐 방법의 키트인 DxSeq BRCA1/2와 타사의 앰플리콘 방법의 키트를 비교해본 결과 5개의 결과가 불일치하였다. 4개의 불일치의 사례는 앰플리콘 방법에서 해당 변이를 검출하지 못하여 발생한 위음성 결과였다. 검출에 실패한 변이 4개 모두 indel variant로, 앰플리콘 방법의 키트에서는 검출하지 못하였다. 다른 연구에 의하면 앰플리콘 방법의 NGS는 indel variant, SNV 검출에 대해 취약하다[14]. 앰플리콘 방식은 PCR 증폭과정을 통해 타겟 유전자 부분을 확보하기 때문에, primer binding 부위와 indel이 겹치는 경우 오류로 인해 coverage 균일성이 낮아지게 되고 변이 판독이 어렵게 된다. 반면, 캡쳐 방식의 NGS는 DNA를 무작위로 잘게 쪼개기 때문에 DNA 조각의 캡쳐가 부분적으로 중복되고 다양하게 진행되므로, SNV 및 insertion/deletion을 비교적 정확하게 감지할 수 있다[15]. Fig. 3을 보면, 불일치 사례 중 3개의 indel variant는 IGV에서 확인이 가능하였다. 이는 NGS의 부화 방법의 차이가 variant calling의 성능에도 영향을 미칠 수 있음을 보여준다[14].

본 연구에서 CNV의 경우 ‘Dxseq BRCA 1/2’에서만 1건 검출되었으며 앰플리콘 방법인 BRCAaccuTest에서는 검출되지 못하였다. 앰플리콘 방식의 target enrichment system은 PCR을 이용한 증폭의 단계를 거치면서 NGS 결과 분석 시 유전자 복제 수를 정량적으로 비교하기 어렵기 때문에 CNV와 같은 큰 사이즈의 증폭 또는 결실 변이를 확인하기 어렵다. Sanger 염기서열분석검사 또한 염기서열분석에 있어 gold standard로 여겨지고 있지만, 검사법의 한계상 CNV를 검출할 수 없다. CNV 검출에 사용할 수 있는 분자 진단기법에는 microarray를 사용한 방법과 MLPA 등이 있지만, 염기서열을 검사하는 Sanger 염기서열분석과 별도로 시행해야 하는 단점이 있다. 한편, NGS를 통해서 CNV를 검출해 내는 방법이 고안되었고, 크게 paired-end mapping, split read, read depth, de novo assembly of a genome, 그리고 이를 조합하는 방법 등의 전략을 통해 이루어지고 있다[16,17]. 이 중 ‘DxSeq BRCA1/2’는 read depth에 기반한 접근방법을 사용하여, NGS sequencing data의 coverage와 depth 정보를 이용해 해당 영역의 deletion 또는 duplication을 추측하여 CNV를 검출하고 있다. 유전성의 BRCA1/2 돌연변이 중 생식계열의 CNV는 연구 모집단에 따라 4%–28%의 빈도로 보고되고 있다[18]. CNV는 유전자 기능에 직접적인 영향을 미치며, 특히 유전자량 변화에 해당하는 multiplication이나 deletion 같은 변이들이 해당 유전자의 최종적인 유전자 산물인 전사체, 혹은 단백질의 증가나 감소를 유발한다고 증명되고 있어 중요성이 증가하고 있다[19]. 따라서 CNV를 찾아내는 변이 검출능은 NGS에서 중요한 부분이다.

다른 NGS 검사법 비교 연구에 따르면 캡쳐 기반 방법이 앰플리콘 기반 방법보다 coverage가 더 우수하다고 보고되고 있다[14,20]. 또한 probe를 통하여 교합하는 캡쳐 기반 방법이 시퀀싱 복잡성 및 균일성 측면에서 더 높은 성능을 보였다.

본 연구에서는 variant가 검출된 양성 검체를 대상으로만 앰플리콘 방법의 패널검사가 시행되었으므로, Sanger 염기서열분석법 또는 ‘DxSeq BRCA1/2’ 키트 검사에서 검출하지 못했을 가능성의 변이에 대한 비교분석은 불가능한 한계를 가진다.

하지만 표준 검사법인 Sanger 염기서열분석법을 기준으로 평가하면, 본 연구의 결과를 토대로 연구에 사용된 ‘DxSeq BRCA 1/2’이 앰플리콘 방법의 패널과 비교하였을 때 좋은 성능을 가졌다고 평가할 수 있다. 따라서 임상검사실에서 환자 진료를 위한 검사로 유의하게 사용될 수 있을 것으로 생각된다.

본 연구는 Dxome Co. Ltd.의 연구비 지원을 받아 이루어졌다.