Lab Med Qual Assur 2023; 45(2): 70-75
Published online June 30, 2023
https://doi.org/10.15263/jlmqa.2023.45.2.70
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Department of Diagnostic Laboratory Medicine, Keimyung University Dongsan Hospital, Keimyung University School of Medicine, Daegu, Korea
Correspondence to:Do-Hoon Kim
Department of Diagnostic Laboratory Medicine, Keimyung University Dongsan Hospital, Keimyung University School of Medicine, 1035 Dalgubeol-daero, Dalseo-gu, Daegu 42601, Korea
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Background: Lynch syndrome (LS) is an autosomal dominant inherited disease caused by germline mutations in one of the DNA mismatch repair (MMR) genes such as mutL homologue 1 (MLH1), mutS homologue 2 (MSH2), MSH6, and postmeiotic segregation increased 2. Most pathogenic variants of LS are single nucleotide polymorphisms, but copy number variations (CNV) account for a significant proportion. Therefore, we investigated the efficacy of multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) using a hereditary cancer next-generation sequencing (NGS) panel and MLPA of MMR genes in patients with LS-related cancer.
Methods: We performed hereditary cancer NGS of 48 genes, including MMR genes, and MLPA, including MLH1, MSH2, and MSH6, in 120 patients with LS-related cancer. The pathogenic variants detected by NGS were confirmed using Sanger sequencing.
Results: Of the 120 patients, 18 had pathogenic variants, of which the six most common were MSH2 gene variants. Of the six MSH2 mutations, three were CNVs detected by MLPA. Nonsense and frameshift mutations were found in MSH6 and MLH1, respectively, in two other patients.
Conclusions: In this study, CNVs were found at a higher rate in the pathogenic variants of MSH2 in patients with LS than in previous studies. Therefore, MLPA must be performed to detect CNVs in the diagnosis of LS.
Keywords: Lynch syndrome I, Lynch syndrome II, Hereditary nonpolyposis colorectal neoplasms, DNA copy number variations, Multiplex polymerase chain reaction, MutS homolog 2 protein
린치 증후군(Lynch syndrome) 또는 유전성 비폴립증 대장암은 전체 대장암의 약 5%에 해당하는 상염색체 우성 유전질환이다[1]. 해당 환자들은 70세까지 대장암의 이환율이 80%에 이르며 발병 평균 나이가 45세 정도로 산발성 대장암 환자들에 비해 조기에 암이 발생한다[2]. 린치 증후군은 발생하는 암의 종류에 따라 I과 II로 구분하기도 하는데, 린치 증후군 I은 대장암만 특이적으로 발생하고 II는 대장암과 다른 장기암이 함께 발견된다[3]. 특히 발생률이 높은 다른 장기암은 자궁내막암이 가장 흔하며 그 외에도 위암, 난소암, 췌담도암, 요관암, 소장암 등이 동반되기도 한다[4,5]. 린치 증후군은 상기의 관련 암이 발생한 가족력이 있는 경우가 많고 발생된 암에 따라 나타나는 임상 양상이 다양할 수 있기 때문에 의심되는 환자에 대해 적절한 진단적 접근이 필요하다.
린치 증후군은 복제실수교정 유전자(mismatch repair gene, MMR)의 생식세포 돌연변이(germline mutation)에 의해 발생하며, MMR 유전자에 결함이 생기면 DNA 복제 실수를 인지하고 교정하지 못하기 때문에 현미부수체 불안정(microsatellite instability, MSI)을 일으켜 암이 발생한다[6,7]. MMR에 관여하는 대표적인 유전자는 mutL homologue 1 (
이에 본 연구에서는 린치 증후군 관련 암을 가진 환자들을 대상으로, MMR 유전자가 포함된 차세대 염기서열분석법(next-generation sequencing, NGS) 기반 유전성 암 유전자 패널검사를 실시하였다. 더불어
2020년 1월부터 2022년 6월까지 계명대학교 동산병원 내에서 유전성 암 유전자 패널검사가 의뢰된 환자들 중 린치 증후군 관련 암인 대장암, 직장암, 자궁내막암, 난소암을 가진 환자들을 대상으로 120명을 선정하였다. 검체는 익명화하여 개인정보가 노출되지 않도록 개인식별코드로 대체하여 사용하였다. 본 연구는 원내 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)의 심의를 받았다(IRB file no., 2023-02-020).
유전체 DNA는 말초혈액에서 QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA의 농도 및 순도는 Nanodrop ND-100 spectrophotometry (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, USA)를 이용하여 확인하였다. DNA 순도는 A260/280에서의 비율이 1.8–2.0 사이임을 확인하였다.
추출한 DNA는 Ion Chef System (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)으로 library preparation을 시행하였고 유전성 암 관련 유전자를 포함하여 주문 제작한 유전자 패널을 Ion S5 sequencer (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 염기서열분석을 시행하였다. 포함된 암 유전자는 모두 48개로
120명 대상 환자는 모두
Ion S5 sequencer에서 생성된 FASTQ 파일은 Torrent Suite software ver. 5.16.1 (Thermo Fisher Scientific) 및 Torrent Variant caller (Thermo Fisher Scientific) 프로그램을 통해 base calling과 alignment를 시행하였다. Annotation은 Ion Reporter Software (Thermo Fisher Scientific) 내의 KRGDB Hereditary ver. 5.16 pipeline을 이용하였다. Reference genome sequence는 human genome build 19를 바탕으로 하였다. 유전성 암 유전자 패널에서 annotation 과정을 거친 변이들 및 MLPA 결과는 American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) and Association of Molecular Pathology의 2015년 가이드라인에 따라 “pathogenic” (PV), “likely pathogenic” (LPV), “uncertain significance” (VUS), “likely benign”, “benign”의 다섯 가지 카테고리로 분류되었고[10], PV, LPV, VUS가 있는 경우에만 결과를 보고하였다. ACMG 가이드라인에 따른 분류를 위해 Clinvar (ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/) 사이트의 변이 분류결과와 QIAGEN Clinical Insight (QIAGEN) 프로그램의 변이 분류결과를 사용하였다.
총 120명의 검사 대상자 중 난소암 환자는 109명, 자궁내막암은 4명, 대장암은 1명, 직장암은 1명이었다. 나머지 5명은 두 가지 암을 진단받은 환자들로, 자궁내막암과 대장암이 2명, 자궁내막암과 직장암이 1명, 난소암과 위암, 그리고 난소암과 폐암이 각각 1명씩이었다. 대상 환자들의 성별은 여성이 118명으로 대부분이었으며 남성이 2명이었다. 전체 나이 평균은 58세(범위, 32–91세)였고 여성 환자의 평균 나이는 58세(범위, 32–91세), 남성 환자의 평균 나이는 44세(범위, 32–55세)였다.
120명의 환자들을 대상으로 유전성 암 유전자 패널 및 MLPA를 시행한 결과, PV를 가진 환자는 3명, LPV는 1명, VUS는 83명이었으며, PV와 VUS를 동시에 가진 환자는 13명, LPV와 VUS를 가진 환자는 1명, PV, LPV, VUS가 모두 발견되지 않은 환자는 19명이었다.
PV 또는 LPV를 가진 환자는 총 18명으로 변이가 발견된 유전자는
MMR 관련 유전자에서 PV가 나온 환자들을 살펴봤을 때,
Table 1 . Pathogenic variants found in
Patient no. | Gene | Nucleotide change | AA change | Variant type |
---|---|---|---|---|
6 | c.1684del | p.Gln562Argfs* | Frameshift | |
20 | c.2731C>T | p.Arg911* | Nonsense | |
44 | c.187del | p.Val63* | Nonsense | |
72 | c.1867_1870del | p.Ala623fs* | Frameshift | |
73 | c.187del | p.Val63* | Nonsense | |
74 | Whole gene deletion | - | Deletion | |
89 | Exon 8 deletion | - | Deletion | |
91 | Exon 1–8 deletion | - | Deletion |
Abbreviations:
린치 증후군의 진단이 중요한 이유는 변이가 있는 환자 및 환자의 가족에 대해 대장암뿐만 아니라 타장기암에 대한 고위험군을 찾아내어 정기검진과 같은 암의 조기 발견을 위한 적극적인 의료적 접근을 하기 위함이다. 여성의 경우에는 자궁내막암으로 가장 흔하게 발병하고[4], 그 외 다른 장기에도 암이 발생할 수 있으므로 이른 나이의 암 발병 또는 린치 증후군 관련 암 발생의 가족력이 있을 경우에는 정확한 진단을 통해 유전성 암의 여부를 확인해야 한다.
린치 증후군의 평가는 임상적 표현형 및 종양의 병리학적 소견과 유전적 검사로 이루어진다. 암스테르담 진단기준 I, II와 수정된 베데스다 진단기준이 린치 증후군의 임상지침으로 사용되고 있으나[2], 린치 증후군이 있는 50% 이상의 환자를 놓칠 수 있다는 보고가 있다[11]. 이에 대장암 환자에게서 수행하는 MSI 검사와 MMR 단백질의 발현 여부를 평가하는 면역조직화학검사가 비용과 효율 측면에서 비교적 효과적인 린치 증후군의 선별검사로 사용되고 있으며 MSI 검사에서 검사 패널에 포함된 5개의 현미부수체 중 두 개 이상의 현미부수체의 불안정성을 보이는 MSI-H (high)일 때 또는 면역조직화학검사에서 특정 단백질이 염색이 되지 않을 경우, 린치 증후군을 진단할 수 있는 유전학적 검사를 선택할 때 중요한 고려 대상이 될 수 있다[6]. 그러나 이러한 결과들은 특정 유전자의 병적 변이를 유추할 수 있는 정도의 정보이며 정확한 원인 파악을 위해서는 유전자 검사로 생식세포 돌연변이 여부를 확인해야 한다.
NGS의 기술적 발전으로 린치 증후군 관련 유전자뿐만 아니라 많은 유전성 암 관련 유전자의 돌연변이를 한 번의 검사로 검출이 가능해졌다. 린치 증후군에서 발견되는 주요한 돌연변이들은 SNV로 현재의 NGS platform에서는 대부분 검출이 가능할 것으로 보이나 본 연구에서와 같이
본 연구의 결과에서 병적 변이가 있는 18명의 환자 중 6명이
린치 증후군 의심 환자들은 앞서 기술한 임상 표현형 및 병리학적 선별검사를 통해 고위험군을 선정하여 유전자검사를 시행하는 과정을 거쳐야 한다. 본 연구에서는 난소암 환자의 수가 많아 암스테르담 진단기준 I, II와 수정된 베데스다 진단기준 및 MSI 검사와 면역조직화학검사를 적용하지 못하였다는 한계점이 있다. 또한
결론적으로, 린치 증후군 의심 환자군에서 진단을 위한 유전학검사를 할 때, SNV 검출 검사뿐 아니라 반드시 CNV 검출을 포함하는 MLPA 검사를 시행하여 린치 증후군의 병적 변이의 상당 부분을 차지하는 CNV를 배제할 수 있어야 한다. 특히 보고된 병적 변이 중 CNV의 비율이 높은
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