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pISSN 2950-9114 eISSN 2950-9122
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Original Article

Lab Med Qual Assur 2024; 46(1): 55-59

Published online March 31, 2024

https://doi.org/10.15263/jlmqa.2024.46.1.55

Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.

CYP3A5 rs776746 Genotyping by SYBR Green-Based Real-Time Multiplex Polymerase Chain Reaction Combined with Melting Curve Analysis Using Tm-Shift Method

Geon Park

Department of Laboratory Medicine, Chosun University College of Medicine, Gwangju, Korea

Correspondence to:Geon Park
Department of Laboratory Medicine, Chosun University Hospital, Chosun University College of Medicine, 365 Pilmun-daero, Dong-gu, Gwangju 61453, Korea
Tel +82-62-220-3272
E-mail creatgeon@chosun.ac.kr, creatgun@naver.com

Received: November 13, 2023; Revised: December 4, 2023; Accepted: December 4, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Abstract

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Background: Cytochrome P450 3A subfamily members (CYP3A5) affects drug reactions and susceptibility to diseases. The homozygotic variant rs776746 (CYP3A5*3/*3; NM_000777.5:c.219-237A>G) genotype is a nonexpressor of CYP3A5 and metabolizes CYP3A5 substrates more slowly than CYP3A5-expressor genotypes (CYP3A5*1/*1 and *1/*3). A rapid and reliable CYP3A5 genotyping is necessary to reduce the risk of adverse drug reactions.
Methods: A total of 101 randomly collected blood samples from hospitalized patients between May 2022 and December 2022 were used to evaluate this rapid CYP3A5 genotyping technique. One allele-nonspecific forward primer and two allele-specific reverse primers (a rs776746 G allele-specific primer with GC-rich sequences and a rs776746 A allele-specific primer without GC-rich sequences) were used for CYP3A5 genotyping. We performed Sanger sequencing to confirm the results of real-time multiplex allele-specific polymerase chain reaction (PCR) and melting curve analysis.
Results: The duration of the analysis of the CYP3A5 genotyping, except DNA extraction, was approximately 1.5 hours. The mean melting temperatures were 79.1℃ and 75.1℃, which were characteristic of rs776746 G allele-specific amplicon and rs776746 A allele-specific amplicon, respectively. Frequencies of CYP3A5*1/*1, CYP3A5*1/*3, and CYP3A5*3/*3 were 7 (6.9%), 40 (39.6%), and 54 (53.5%) in 101 samples, respectively. The concordance rate between the real-time PCR combined with melting curve analysis and Sanger sequencing was 100%.
Conclusions: CYP3A5 genotyping by SYBR Green-based real-time multiplex PCR combined with melting curve analysis using three unlabeled primers including the melting temperature-shift primer in a single tube is a rapid and reliable technique for routine laboratory testing.

Keywords: CYP3A5, Genotyping, Real-time polymerase chain reaction

서론

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Cytochrome P450 3A subfamily members (CYP3A)는 간 cytochrome P450 중 가장 풍부한 형으로 임상에서 사용하는 약물의 50% 이상을 대사한다. 이 중 CYP3A4와 CYP3A5 동형(isoform) 효소는 표현과 활성도의 개인 간 차이가 크며, 약물반응과 질병 취약성과 관련 있다[1]. 특히 대표적인 면역억제제인 tacrolimus의 대사에 CYP3A5가 중요한 역할을 하여 tacrolimus에 의한 약물 부작용 예방을 위해 CYP3A5 유전형에 따라 tacrolimus 치료를 달리 할 것을 강하게 권고하고 있다[2]. 대부분의 CYP3A5 유전형 검사는 rs776746 단일염기변이를 표적으로 하여 CYP3A5*1과 CYP3A5*3을 감별하고 있다[3]. rs776746 (NM_000777.5:c.219-237A>G)은 인트론 3번에 위치하는 변이로 인해 발생한 splicing defect로 미성숙 정지 코돈이 형성되고, 그 결과 효소 활성이 거의 없는 CYP3A5 단백질이 합성된다[4]. CYP3A5 유전형 검사를 위해 염기서열분석법[5], 제한효소절편길이다형성법[6], 대립유전자특이중합효소연쇄반응법[7], 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 이용한 고해상도융해곡선분석법(high resolution melting curve analysis, HRM) [8], Taqman 소식자를 이용한 실시간중합효소연쇄반응법[9], SyBr Green을 이용한 고해상도융해곡선분석법[10] 등의 다양한 기법을 이용하고 있다. 염기서열분석법은 염기서열분석장비와 같은 특수한 장비가 필요하고, 제한효소절편길이다형법과 대립유전자특이중합효소연쇄반응법은 전기영동 과정이 필요하여 검사시간이 길고 많은 노동력이 요구된다. 형광색소를 이용한 기법들은 상대적으로 검사시간이 짧고 더 적은 노동력을 필요로 하지만, FRET를 이용한 HRM 기법과 Taqman 소식자를 이용한 기법은 상대적으로 비싼 형광표지소식자(fluorescence-labelled probe)가 필요하고 FRET 또는 SyBr Green을 이용한 HRM 기법을 위해서는 고가의 HRM 분석 소프트웨어가 필요하다[11].

이에 본 연구자는 형광표지소식자와 HRM 분석 소프트웨어가 필요 없는 융해온도-전이(melting temperature-shift, Tm-shift) 시발체를 이용한 SyBr Green 기반의 실시간중합효소연쇄반응법을 개발하여 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

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1. 검체 및 DNA 추출

2022년 5월부터 2022년 12월까지 총혈구계산을 위해 의뢰되어 검사 후 폐기 예정인 혈액 검체 101개를 무작위로 수집하여 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 회사 지침에 따라 DNA를 추출하였다. 본 연구는 조선대학교병원 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)의 심의를 받았다(IRB file no., 2022-04-006).

2. 실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석

Polymerase chain reaction (PCR) 반응액은 2X PalmTaq Master Mix (Ahram Biosystems, Seoul, Korea) 10 µL, DNA 1 µL, CYP3A5cmF (5’-TGTACCACCCAGCTTAACGA-3’) 0.5 µM, CYP3A5AspR (5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGgTAT-3’) 0.15 µM, CYP3A5GCtailGspR (5’-CGGCGGGCGGGCGGGCGGGGTCCAAACAGGGAAGAGAaAC-3’) 0.35 µM, 20X EvaGreen (Biotium, Hayward, CA, USA) 1 µL와 증류수를 첨가하여 총 20 µL가 되도록 하였다. 시발체 염기서열에서 소문자는 대립유전자를 잘 구분하기 위해 의도적으로 변경한 염기를 표시하며, 굵은 글씨체는 융해온도를 높이기 위해 의도적으로 삽입한 구아닌(guanine) 및 시토신(cytosine) 풍부 서열을 표시하였다. CFX96 Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 다음 조건으로 실시간중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 진행하였다. 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 10초, 63℃ 15초, 72℃ 30초씩 45회 증폭한 후 70℃에서 90℃까지 초당 0.3℃ 속도로 온도를 상승시켜 융해곡선을 얻었다. 융해곡선의 peak 값이 -d(RFU)/dT 400을 넘을 때 의미 있는 증폭으로 판정하였다.

3. DNA 염기서열분석

실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석 결과를 확인하기 위하여 염기서열분석을 실시하였다. PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara, Kyoto, Japan) 10 µL, DNA 2 µL, 전방(5’- TGTACCACCCAGCTTAACGA-3’) 및 후방(5'- CAGCACAGGGAGTTGACCTT-3') 시발체 각 0.5 µM 및 증류수를 첨가하여 총 20 µL가 되도록 하여 Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 1분씩 35회 증폭하였다. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific)와 ABI 3730XL (Thermo Fisher Scientific)로 상기 각 PCR 시발체를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

4. 통계분석

실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석법의 결과와 염기서열분석 결과를 비교 평가하기 위해 Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)를 이용하여 일치율을 분석하였다.

결과

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DNA 추출시간을 제외한 CYP3A5 유전형 검사시간은 약 1.5시간이었다. rs776746 G-대립유전자특이 증폭산물과 rs776746 A-대립유전자특이 증폭산물의 평균 융해온도는 각각 79.1℃, 75.1℃였다(Fig. 1). 101개 검체에서 CYP3A5*1/*1, CYP3A5*1/*3와 CYP3A5*3/*3의 빈도는 각각 7 (6.9%), 40 (39.6%)와 54 (53.5%)였다(Table 1). 실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석법의 결과와 염기서열분석법의 결과는 100% 일치하였다.

Table 1 . Results of real-time PCR with melting curve analysis and sequencing for CYP3A5 genotyping.

No. of RMC (%)No. of sequencing (%)Concordance %
Alleles
*154 (26.7)54 (26.7)100.0
*3148 (73.3)148 (73.3)100.0
Total202 (100.0)202 (100.0)100.0
Genotypes
*1/*17 (6.9)7 (6.9)100.0
*1/*340 (39.6)40 (39.6)100.0
*3/*354 (53.5)54 (53.5)100.0
Total101 (100.0)101 (100.0)100.0

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; RMC, real-time PCR with melting curve analysis..

Figure 1. Representative derivative melting curves of rs776746 AA (blue line), AG (black line), and GG (red line) genotypes.

고찰

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CYP3A5 유전자는 염색체 7q21.1에 위치하는 cytochrome P450 유전자 클러스터(cluster)의 일부분이며, CYP3A5 단백질은 52.5 kDa이다[12]. CYP3A5 유전자는 발현 수준에서 개인 간 편차가 크고 높은 다형성을 보인다[13]. 여러 대립유전자 중 CYP3A5*1이 기능을 가진 CYP3A5.1 단백질 정보를 담고 있으며, 아프리카인을 제외하고 가장 흔한 CYP3A5 대립유전자는 CYP3A5*3이고 이 대립유전자는 기능이 거의 없는 CYP3A5.3 단백질 정보를 담고 있다[14-16]. CYP3A5*3은 tacrolimus, everolimus, cyclosporine, vincristine, tamoxifen, midazolam, alprazolam, amlodipine, indinavir, quinine 및 verapamil 등과 같이 CYP3A5에 의해 주로 대사되는 약물을 사용할 때 독성 부작용을 주의를 해야 한다[13]. 그리고 CYP3A5*1의 경우 위 약물 대사가 빠르다는 것도 주의해야 한다. 예를 들어 CYP3A5*1 신장 이식 환자에게 tacrolimus를 사용한 경우 급성 신장 이식 거부가 비표현형에 비해 더 높은 비율로 발생했다는 보고가 있다[17]. 이와 같이 CYP3A5 유전형에 따라 적절한 용법을 선택하고 유효 농도를 잘 유지할 수 있도록 치료약물농도감시(therapeutic drug monitoring)를 실시해야 한다[18]. 또한 CYP3A5*3/*3이 혈압과 관련이 있다는 보고가 있었으나, 최근 메타분석연구에서는 관련이 없다고 보고하였다[19]. 일본인에서 CYP3A5와 유방암과의 관련성이 보고되었으며, 인도인에서 CYP3A5*3이 만성골수성백혈병 발생위험이 더 높다고 보고되었다[4].

dbSNP 데이터베이스에는 한국인을 포함한 다양한 인종의 rs776746 변이 빈도가 게시되어 있다[15]. 한국인에서 CYP3A5*1은 22.5%이고 CYP3A5*3은 77.5%이다. 본 연구에서 CYP3A5*1은 26.7%, CYP3A5*3은 73.3%로 위 보고와 유사하였다(Table 1). 아프리카인은 CYP3A5*1 (69.6%)이 CYP3A5*3 (30.4%)보다 더 많으며, 유럽인의 경우 CYP3A5*3 (93.0%)의 빈도가 한국인보다 더 높다.

본 연구에 이용한 Tm-shift 시발체 기법은 Wang 등[20]이 개발한 것으로 대립유전자특이 시발체의 5’ 끝에 GC-풍부 꼬리(GC-rich tail)를 붙여 그 증폭산물의 융해온도를 올리고 그 융해온도의 차이를 이용하여 대립유전자를 구분하는 기법이다. 이 기법을 이용하면 형광표지소식자와 HRM 분석용 소프트웨어가 필요 없으며, 형광표지가 없는 단순한 시발체만으로도 효과적으로 대립유전자를 구분할 수 있다. 본 연구에서도 GC-풍부 꼬리(CGGCGGGCGGGCGGGCGG)를 G-대립유전자특이 시발체에 붙여서 융해온도를 평균 4℃ 정도 높여 G-대립유전자특이 증폭산물과 A-대립유전자특이 증폭산물을 쉽게 구분할 수 있었다. Tm-shift 시발체를 디자인할 때 dimer가 생기지 않도록 주형에 결합하는 시발체 부위와 GC-풍부 꼬리 사이에 높은 결합이 없도록 주의해야 한다.

결론적으로, 본 연구에서는 Tm-shift 시발체를 이용한 SyBr Green 기반의 실시간중합효소연쇄반응법으로 CYP3A5 유전형을 성공적으로 판정할 수 있었으며, 이 방법은 신속하고 신뢰할 만한 검사법으로 생각된다.

감사의 글

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이 연구는 조선대학교(2023)의 연구비 지원을 받아 수행되었다.

References

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