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pISSN 2950-9114 eISSN 2950-9122
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Original Article

Lab Med Qual Assur 2024; 46(1): 55-59

Published online March 31, 2024

https://doi.org/10.15263/jlmqa.2024.46.1.55

Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.

CYP3A5 rs776746 Genotyping by SYBR Green-Based Real-Time Multiplex Polymerase Chain Reaction Combined with Melting Curve Analysis Using Tm-Shift Method

Geon Park

Department of Laboratory Medicine, Chosun University College of Medicine, Gwangju, Korea

Correspondence to:Geon Park
Department of Laboratory Medicine, Chosun University Hospital, Chosun University College of Medicine, 365 Pilmun-daero, Dong-gu, Gwangju 61453, Korea
Tel +82-62-220-3272
E-mail creatgeon@chosun.ac.kr, creatgun@naver.com

Received: November 13, 2023; Revised: December 4, 2023; Accepted: December 4, 2023

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Background: Cytochrome P450 3A subfamily members (CYP3A5) affects drug reactions and susceptibility to diseases. The homozygotic variant rs776746 (CYP3A5*3/*3; NM_000777.5:c.219-237A>G) genotype is a nonexpressor of CYP3A5 and metabolizes CYP3A5 substrates more slowly than CYP3A5-expressor genotypes (CYP3A5*1/*1 and *1/*3). A rapid and reliable CYP3A5 genotyping is necessary to reduce the risk of adverse drug reactions.
Methods: A total of 101 randomly collected blood samples from hospitalized patients between May 2022 and December 2022 were used to evaluate this rapid CYP3A5 genotyping technique. One allele-nonspecific forward primer and two allele-specific reverse primers (a rs776746 G allele-specific primer with GC-rich sequences and a rs776746 A allele-specific primer without GC-rich sequences) were used for CYP3A5 genotyping. We performed Sanger sequencing to confirm the results of real-time multiplex allele-specific polymerase chain reaction (PCR) and melting curve analysis.
Results: The duration of the analysis of the CYP3A5 genotyping, except DNA extraction, was approximately 1.5 hours. The mean melting temperatures were 79.1℃ and 75.1℃, which were characteristic of rs776746 G allele-specific amplicon and rs776746 A allele-specific amplicon, respectively. Frequencies of CYP3A5*1/*1, CYP3A5*1/*3, and CYP3A5*3/*3 were 7 (6.9%), 40 (39.6%), and 54 (53.5%) in 101 samples, respectively. The concordance rate between the real-time PCR combined with melting curve analysis and Sanger sequencing was 100%.
Conclusions: CYP3A5 genotyping by SYBR Green-based real-time multiplex PCR combined with melting curve analysis using three unlabeled primers including the melting temperature-shift primer in a single tube is a rapid and reliable technique for routine laboratory testing.

Keywords: CYP3A5, Genotyping, Real-time polymerase chain reaction

Cytochrome P450 3A subfamily members (CYP3A)는 간 cytochrome P450 중 가장 풍부한 형으로 임상에서 사용하는 약물의 50% 이상을 대사한다. 이 중 CYP3A4와 CYP3A5 동형(isoform) 효소는 표현과 활성도의 개인 간 차이가 크며, 약물반응과 질병 취약성과 관련 있다[1]. 특히 대표적인 면역억제제인 tacrolimus의 대사에 CYP3A5가 중요한 역할을 하여 tacrolimus에 의한 약물 부작용 예방을 위해 CYP3A5 유전형에 따라 tacrolimus 치료를 달리 할 것을 강하게 권고하고 있다[2]. 대부분의 CYP3A5 유전형 검사는 rs776746 단일염기변이를 표적으로 하여 CYP3A5*1과 CYP3A5*3을 감별하고 있다[3]. rs776746 (NM_000777.5:c.219-237A>G)은 인트론 3번에 위치하는 변이로 인해 발생한 splicing defect로 미성숙 정지 코돈이 형성되고, 그 결과 효소 활성이 거의 없는 CYP3A5 단백질이 합성된다[4]. CYP3A5 유전형 검사를 위해 염기서열분석법[5], 제한효소절편길이다형성법[6], 대립유전자특이중합효소연쇄반응법[7], 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 이용한 고해상도융해곡선분석법(high resolution melting curve analysis, HRM) [8], Taqman 소식자를 이용한 실시간중합효소연쇄반응법[9], SyBr Green을 이용한 고해상도융해곡선분석법[10] 등의 다양한 기법을 이용하고 있다. 염기서열분석법은 염기서열분석장비와 같은 특수한 장비가 필요하고, 제한효소절편길이다형법과 대립유전자특이중합효소연쇄반응법은 전기영동 과정이 필요하여 검사시간이 길고 많은 노동력이 요구된다. 형광색소를 이용한 기법들은 상대적으로 검사시간이 짧고 더 적은 노동력을 필요로 하지만, FRET를 이용한 HRM 기법과 Taqman 소식자를 이용한 기법은 상대적으로 비싼 형광표지소식자(fluorescence-labelled probe)가 필요하고 FRET 또는 SyBr Green을 이용한 HRM 기법을 위해서는 고가의 HRM 분석 소프트웨어가 필요하다[11].

이에 본 연구자는 형광표지소식자와 HRM 분석 소프트웨어가 필요 없는 융해온도-전이(melting temperature-shift, Tm-shift) 시발체를 이용한 SyBr Green 기반의 실시간중합효소연쇄반응법을 개발하여 이를 보고하고자 한다.

1. 검체 및 DNA 추출

2022년 5월부터 2022년 12월까지 총혈구계산을 위해 의뢰되어 검사 후 폐기 예정인 혈액 검체 101개를 무작위로 수집하여 QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 회사 지침에 따라 DNA를 추출하였다. 본 연구는 조선대학교병원 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)의 심의를 받았다(IRB file no., 2022-04-006).

2. 실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석

Polymerase chain reaction (PCR) 반응액은 2X PalmTaq Master Mix (Ahram Biosystems, Seoul, Korea) 10 µL, DNA 1 µL, CYP3A5cmF (5’-TGTACCACCCAGCTTAACGA-3’) 0.5 µM, CYP3A5AspR (5’-GGTCCAAACAGGGAAGAGgTAT-3’) 0.15 µM, CYP3A5GCtailGspR (5’-CGGCGGGCGGGCGGGCGGGGTCCAAACAGGGAAGAGAaAC-3’) 0.35 µM, 20X EvaGreen (Biotium, Hayward, CA, USA) 1 µL와 증류수를 첨가하여 총 20 µL가 되도록 하였다. 시발체 염기서열에서 소문자는 대립유전자를 잘 구분하기 위해 의도적으로 변경한 염기를 표시하며, 굵은 글씨체는 융해온도를 높이기 위해 의도적으로 삽입한 구아닌(guanine) 및 시토신(cytosine) 풍부 서열을 표시하였다. CFX96 Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 다음 조건으로 실시간중합효소연쇄반응법 및 융해곡선분석을 진행하였다. 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 10초, 63℃ 15초, 72℃ 30초씩 45회 증폭한 후 70℃에서 90℃까지 초당 0.3℃ 속도로 온도를 상승시켜 융해곡선을 얻었다. 융해곡선의 peak 값이 -d(RFU)/dT 400을 넘을 때 의미 있는 증폭으로 판정하였다.

3. DNA 염기서열분석

실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석 결과를 확인하기 위하여 염기서열분석을 실시하였다. PCR 반응액은 2X EmeraldAMP GT PCR Master Mix (Takara, Kyoto, Japan) 10 µL, DNA 2 µL, 전방(5’- TGTACCACCCAGCTTAACGA-3’) 및 후방(5'- CAGCACAGGGAGTTGACCTT-3') 시발체 각 0.5 µM 및 증류수를 첨가하여 총 20 µL가 되도록 하여 Veriti 96-Well Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 98℃에서 3분간 처리한 후에 98℃ 15초, 55℃ 30초, 72℃ 1분씩 35회 증폭하였다. BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific)와 ABI 3730XL (Thermo Fisher Scientific)로 상기 각 PCR 시발체를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

4. 통계분석

실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석법의 결과와 염기서열분석 결과를 비교 평가하기 위해 Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)를 이용하여 일치율을 분석하였다.

DNA 추출시간을 제외한 CYP3A5 유전형 검사시간은 약 1.5시간이었다. rs776746 G-대립유전자특이 증폭산물과 rs776746 A-대립유전자특이 증폭산물의 평균 융해온도는 각각 79.1℃, 75.1℃였다(Fig. 1). 101개 검체에서 CYP3A5*1/*1, CYP3A5*1/*3와 CYP3A5*3/*3의 빈도는 각각 7 (6.9%), 40 (39.6%)와 54 (53.5%)였다(Table 1). 실시간중합효소연쇄반응법-융해곡선분석법의 결과와 염기서열분석법의 결과는 100% 일치하였다.

Table 1 . Results of real-time PCR with melting curve analysis and sequencing for CYP3A5 genotyping.

No. of RMC (%)No. of sequencing (%)Concordance %
Alleles
*154 (26.7)54 (26.7)100.0
*3148 (73.3)148 (73.3)100.0
Total202 (100.0)202 (100.0)100.0
Genotypes
*1/*17 (6.9)7 (6.9)100.0
*1/*340 (39.6)40 (39.6)100.0
*3/*354 (53.5)54 (53.5)100.0
Total101 (100.0)101 (100.0)100.0

Abbreviations: PCR, polymerase chain reaction; RMC, real-time PCR with melting curve analysis..



Figure 1. Representative derivative melting curves of rs776746 AA (blue line), AG (black line), and GG (red line) genotypes.

CYP3A5 유전자는 염색체 7q21.1에 위치하는 cytochrome P450 유전자 클러스터(cluster)의 일부분이며, CYP3A5 단백질은 52.5 kDa이다[12]. CYP3A5 유전자는 발현 수준에서 개인 간 편차가 크고 높은 다형성을 보인다[13]. 여러 대립유전자 중 CYP3A5*1이 기능을 가진 CYP3A5.1 단백질 정보를 담고 있으며, 아프리카인을 제외하고 가장 흔한 CYP3A5 대립유전자는 CYP3A5*3이고 이 대립유전자는 기능이 거의 없는 CYP3A5.3 단백질 정보를 담고 있다[14-16]. CYP3A5*3은 tacrolimus, everolimus, cyclosporine, vincristine, tamoxifen, midazolam, alprazolam, amlodipine, indinavir, quinine 및 verapamil 등과 같이 CYP3A5에 의해 주로 대사되는 약물을 사용할 때 독성 부작용을 주의를 해야 한다[13]. 그리고 CYP3A5*1의 경우 위 약물 대사가 빠르다는 것도 주의해야 한다. 예를 들어 CYP3A5*1 신장 이식 환자에게 tacrolimus를 사용한 경우 급성 신장 이식 거부가 비표현형에 비해 더 높은 비율로 발생했다는 보고가 있다[17]. 이와 같이 CYP3A5 유전형에 따라 적절한 용법을 선택하고 유효 농도를 잘 유지할 수 있도록 치료약물농도감시(therapeutic drug monitoring)를 실시해야 한다[18]. 또한 CYP3A5*3/*3이 혈압과 관련이 있다는 보고가 있었으나, 최근 메타분석연구에서는 관련이 없다고 보고하였다[19]. 일본인에서 CYP3A5와 유방암과의 관련성이 보고되었으며, 인도인에서 CYP3A5*3이 만성골수성백혈병 발생위험이 더 높다고 보고되었다[4].

dbSNP 데이터베이스에는 한국인을 포함한 다양한 인종의 rs776746 변이 빈도가 게시되어 있다[15]. 한국인에서 CYP3A5*1은 22.5%이고 CYP3A5*3은 77.5%이다. 본 연구에서 CYP3A5*1은 26.7%, CYP3A5*3은 73.3%로 위 보고와 유사하였다(Table 1). 아프리카인은 CYP3A5*1 (69.6%)이 CYP3A5*3 (30.4%)보다 더 많으며, 유럽인의 경우 CYP3A5*3 (93.0%)의 빈도가 한국인보다 더 높다.

본 연구에 이용한 Tm-shift 시발체 기법은 Wang 등[20]이 개발한 것으로 대립유전자특이 시발체의 5’ 끝에 GC-풍부 꼬리(GC-rich tail)를 붙여 그 증폭산물의 융해온도를 올리고 그 융해온도의 차이를 이용하여 대립유전자를 구분하는 기법이다. 이 기법을 이용하면 형광표지소식자와 HRM 분석용 소프트웨어가 필요 없으며, 형광표지가 없는 단순한 시발체만으로도 효과적으로 대립유전자를 구분할 수 있다. 본 연구에서도 GC-풍부 꼬리(CGGCGGGCGGGCGGGCGG)를 G-대립유전자특이 시발체에 붙여서 융해온도를 평균 4℃ 정도 높여 G-대립유전자특이 증폭산물과 A-대립유전자특이 증폭산물을 쉽게 구분할 수 있었다. Tm-shift 시발체를 디자인할 때 dimer가 생기지 않도록 주형에 결합하는 시발체 부위와 GC-풍부 꼬리 사이에 높은 결합이 없도록 주의해야 한다.

결론적으로, 본 연구에서는 Tm-shift 시발체를 이용한 SyBr Green 기반의 실시간중합효소연쇄반응법으로 CYP3A5 유전형을 성공적으로 판정할 수 있었으며, 이 방법은 신속하고 신뢰할 만한 검사법으로 생각된다.

이 연구는 조선대학교(2023)의 연구비 지원을 받아 수행되었다.

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