신요로계 질환의 진단과 치료 여부를 판정하고 내분비 및 대사성 질환의 경과를 관찰하는 데 임상에서 널리 쓰이는 요침사검사법은 자동화장비를 이용하는 자동 요침사검사법과 현미경을 이용하여 직접 계수하는 수기 요침사검사법으로 크게 나눌 수 있다[1]. 수기 요침사검사법의 특성상 발생하는 검사기기, 검사자 및 검사실 간 차이를 줄이고자 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [2,3], European Confederation of Laboratory Medicine (ELCM) [4], Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards (JCCLS) [5,6], 대한임상검사정도관리협회[7], 대한임상화학회[8], 대한진단검사의학회[9,10]에서 요침사검사의 수기법에 대한 가이드라인을 제시하였다.

시야 수(field number)는 대안렌즈로 관찰되는 면적과 밀접한 관련이 있는데, 현미경 대안렌즈를 통해 관찰되는 시야의 원지름(circle diameter, mm)은 “대안렌즈 시야 수 대안렌즈 확대율”로 정의된다. 일반적으로 쓰이는 대안렌즈의 시야 수는 18, 20 및 22인데, 요검경에 주로 이용하는 40배 대안렌즈 확대율을 적용하면 고배율시야(high-power field, HPF)의 원넓이는 각각 0.159, 0.196 및 0.238 mm²으로 시야 수 22 대안렌즈의 HPF가 시야 수 18 대안렌즈의 HPF보다 1.5배 정도 더 넓다(Fig. 1) [11]. 이와 같이 대안렌즈의 시야 수가 다른 현미경을 사용하면 HPF당 보고되는 세포 수에 차이가 발생한다. 위 가이드라인 중 일부[5,7]에서 시야 수를 표준화할 것을 제안하고 있으나 그 방법은 다양하다. 시야 수를 표준화하기 위해서는 정해진 시야 수를 가지는 대안렌즈만 사용하게 하거나 정해진 시야 수를 가지는 대안렌즈의 HPF 면적을 기준으로 세포 수를 변환하는 방법이 있을 것이다. 그러나 기준 시야 수를 가지는 대물렌즈의 HPF 면적으로 세포수를 변환하는 방법에 대한 표준화 연구는 찾아보기 힘들다.

Figure 1. Diameter and area of the high-power field of view at 400× magnification based on the field number (FN) of the main eyepiece.

이에 본 연구자는 시야 수 18 및 22 대안렌즈로 계수된 HPF당 세포 수를 시야 수 20 대안렌즈를 기준으로 HPF당 세포 수로 변환하고 시야 수 20 대안렌즈로 실제 계수한 HPF당 세포 수와 비교하여 HPF 표준화법을 검증하고 문헌고찰과 함께 보고하고자 한다.

1. 주요 요침사검사 가이드라인 비교

CLSI GP16-A3 가이드라인[2], CLSI point-of-care testing (POCT) 10-A2 가이드라인[3], ELCM 가이드라인[4], JCCLS GP1–P4 가이드라인[5], 대한임상검사정도관리협회 2015년 요경검 가이드라인[7], 대한임상화학회 2017년 요침사검사의 표준지침[8], 대한진단검사의학 교과서 5판[9], 대한진단검사의학 교과서 6판[10]을 비교 정리하였다.

2. 검체

2021년 9월부터 10월까지 요검사가 의뢰된 검체 중 UF-5000 (Sysmex, Kobe, Japan)에서 적혈구 또는 백혈구가 관찰된 요 검체를 대상으로 하였다. 적혈구가 양성인 100개 검체와 백혈구가 양성인 100개 검체를 이용하였다. 요 검체는 2시간 이내의 신선한 요를 보존제 처리 없이 사용하였다. 요검사실 검사자가 위의 검체 조건에 맞는 검체를 선별하여 식별 가능한 모든 식별자를 제거하여 냉장고의 정해진 위치에 두고, 이 암호화된 검체를 연구자가 이용하였다.

3. 요침사검사

요침사검사는 일부 수정된 JCCLS 가이드라인[5]에 따라 진행하였다. 눈금이 표시된 원추형 원심관(Sewon Medical, Busan, Korea)에 요 10 mL를 채우고 원심분리기 KUBOTA 5930 (KUBOTA, Osaka, Japan)를 이용하여 500 g에 5분간 원침한 후 혈청분리튜브를 이용하여 상층액을 제거하고 0.5 mL (20배 농축)를 남겼다. JCCLS에서는 0.2 mL를 남기라고 하였지만 0.2 mL를 정확히 남기기가 어려워 0.5 mL로 프로토콜을 수정하였다. JCCLS 가이드라인[6]을 참조하여 요침사액 45 µL에 Prescott–Brodie 염색액 5 µL를 넣어 염색하였다. 파이펫을 이용하여 염색된 요침사액 15 µL를 75×26×1 mm의 유리슬라이드(Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany)에 분주하고 그 위에 18×18 mm 면적과 170±5 µm 두께의 커버슬립(Marienfeld)을 천천히 덮어 요침사액이 커버슬립을 넘치지 않도록 하였다. 광학현미경 (Olympus CX-31; Olympus, Tokyo, Japan)와 시야 수 20 (Olympus), 시야 수 18 (Wally Sky, Anyang, China), 그리고 시야 수 22 (Wally Sky)인 대안렌즈 및 40배 배율을 가진 대물렌즈(Olympus)를 이용하여 10개 이상의 HPF를 검경하여 적혈구와 백혈구 개수를 계수하였다. 이 계수된 값에 1.1을 곱하여 Prescott-Brodie 염색액에 의한 희석효과를 보정하였다. 세 개의 대안렌즈로 검경할 때 검경한 영역이 최대한 겹치도록 노력하였다. 그 결과값을 시야 수 20에서 HPF당 세포 수(RBC20, WBC20), 시야 수 18에서 HPF당 세포 수(RBC18, WBC18) 그리고 시야 수 22에서 HPF당 세포 수(RBC22, WBC22)로 정리하였다.

4. 시야 수 20을 기준으로 시야 수 18과 시야 수 22의 결과 변환

시야 수 18 대안렌즈로 계수된 RBC18 및 WBC18 그리고 시야 수 22 대안렌즈로 계수된 RBC22 및 WBC22를 변환계수(conversion factor)를 곱하여 RBC18c20 및 WBC18c20 그리고 RBC22c20 및 WBC22c20으로 각각 변환하였다. 시야 수 사이의 면적비율을 변환계수로 이용하였다. 시야 수 18의 대안렌즈로 측정한 HPF당 세포 수를 시야 수 20의 결과로 변환하는 데 이용한 변환계수는 1.23 (=0.196/0.159)이었으며, 시야 수 22의 대안렌즈로 측정한 HPF당 세포 수를 시야 수 20의 결과로 변환하는 데 이용한 변환계수는 0.82 (=0.196/0.238)이었다.

5. 통계학적 분석

통계학적 분석은 IBM SPSS ver. 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하였다. RBC20와 RBC18c20 및 RBC22c20 사이 그리고 WBC20와 WBC18c20 및 WBC22c20 사이 각각의 상관도를 Pearson 상관분석으로 분석하였고, Excel 365 (Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)을 이용하여 회귀방정식과 결정계수(R²)를 구하였다. 모든 통계량의 유의수준은 P<0.05로 하였다.

본 연구는 조선대학교병원 임상시험심사위원회의 검토 및 승인을 받았다(2021-04-017).

1. 주요 요침사검사 가이드라인 비교

CLSI GP16-A3 가이드라인[2], CLSI POCT 10-A2 가이드라인[3], JCCLS GP1–P4 가이드라인[4], ELCM 가이드라인[6], 대한임상검사정도관리협회 2015년 요경검 가이드라인[7], 대한임상화학회 2017년 요침사검사의 표준지침[8], 대한진단검사의학 교과서 5판[9], 대한진단검사의학 교과서 6판[10]을 비교하여 Table 1에 정리하였다.

Table 1 . Summary of primary variables analyzed during urine sediment examination.

Variable	Guidelines
	CLSI GP16-A3	CLSI POCT 10-A2	ELCM	JCCLS GP1-P4	KAEQAS	KSCC	KSLM 5th	KSLM 6th	In this study
Urine storage time (hr)	2	2	4 at 4℃, 0.5 at RT	4	4	NA	2	2	4
Initial volume (mL)	NS	12	NS (5–15)	10	10	10	10	10	10
Centrifuge type	NA	NA	NA	Swing-type	Swing-type	NA	Swing-type	NA	Swing-type
Relative centrifugal force (×g)	400	400	400	500	500	400	450–500	400	500
Centrifugation time (min)	5	5	5	5	5	5	5	5	5
Concentration fold	NS	NS	20	50	50–20	30	20 or 10	NS (67–18)	20
Urine sediment volume (mL)	NS	NS	NS (0.25–0.75)	0.2	0.2–0.5	0.33±0.1	0.5 or 1	NS (0.15–0.55)	0.5
Slide size (mm)	NS	NA	NS	75×26	NA	NA	NA	NA	75×26
Sediment volume examined	Measured volume	1 drop	13 μL (18×18 mm), 35–50 μL (24×32 mm)	15 μL	15–20 μL	1 drop (20 μL)	1 drop	1 drop (20 μL)	15 μL
Cover slip size (mm)	NS	NA	18×18, 24×32	18×18	18×18	18×18	NA	18×18	18×18
Field number of eyepieces	NS	NA	Decided field number	20	NA	22	NA	NA	20, 18, 22
Reporting format	Cells/mL	Cells/HPF	Cells/HPF, cells/L	Grade of cells/HPF	Grade of cells/HPF	Cells/HPF, cells/μL	Grade of cells/HPF	Cells/HPF	Cells/HPF
References	[2]	[3]	[4]	[5]	[7]	[8]	[9]	[10]

Abbreviations: CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute; POCT, point-of-care testing; ELCM, European Confederation of Laboratory Medicine; JCCLS, Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards; KAEQAS, Korean Association of External Quality Assessment Service; KSCC, Korean Society of Clinical Chemistry; KSLM, Korean Society for Laboratory Medicine; RT, room temperature; NA, not available; NS, not specified; HPF, high-power field..

2. RBC20과 RBC18c20 및 RBC22c20과의 상관성

RBC20과 RBC18c20 간에 높은 상관성을 보였다(y=1.0007x– 0.1633; R²=0.999, P<0.001). 또한 RBC20과 RBC22c20 간에도 높은 상관성이 보였다(y=1.0041x–0.3663; R²=9.998, P<0.001) (Fig. 2).

Figure 2. Linear curves, linear regression equations, and coefficients of determination between RBC20 and RBC18c20 (A) and RBC22c20 (B). Abbreviations: RBC, red blood cell; HPF, high-power field.

3. WBC20과 WBC18c20 및 WBC22c20와의 상관성

WBC20과 WBC18c20 간에 높은 상관성을 보였다(y=1.0004x+ 0.1421; R²=9.998, P<0.001). 또한 WBC20과 WBC22c20 간에도 높은 상관성이 보였다(y=0.9933x+0.3619; R²=9.998, P<0.001) (Fig. 3).

Figure 3. Linear curves, linear regression equations, and coefficients of determination between WBC20 and WBC18c20 (A) and WBC22c20 (B). Abbreviations: WBC, white blood cell; HPF, high-power field.

세계 여러 기관에서 요침사검사의 가이드라인을 제시하고 있으나, 전 세계적으로 인정받는 요침사검사의 표준 검사법은 없는 실정이다[12]. Table 1에서 보듯이 JCCLS와 임상화학회 가이드라인은 요침사검사에 영향을 미칠 수 있는 여러 변수에 대해 특정한 기준을 제시하고 있다. 본 연구에서는 더 많은 특정 변수를 제안한 JCCLS 가이드라인를 일부 수정하여 연구를 진행하였다. CLSI, ELCM, KAEQAS 및 KSLM에서는 변수에 대해 특정하지 않고 검사실에서 직접 정하여 요침사검사를 수행할 것을 제안하고 있는데, 이 경우 검사실 내에서는 일관성 있는 요침사검사 결과를 제공할 수 있으나, 검사실 간 비교는 어려울 수 있다. 요침사검사 결과의 검사실 간 비교를 위해서는 가능한 많은 변수에 대해 특정하고 이에 따라 수기 요침사검사를 실시하도록 교육하는 것이 필요할 것으로 생각된다.

시야 수에 따라 관찰하는 HPF 면적이 다르게 되므로 요침사검사 표준화를 위해 CLSI, ELCM, JCCLS와 대한임상화학회 가이드라인에서는 대안렌즈의 시야 수를 어떻게 다룰 것인지 기술하고 있다(Table 1). CLSI와 ELCM은 검사실 내에서 한 가지 시야 수를 가지는 대안렌즈만을 사용할 것을 제안하고 있고 JCCLS와 대한임상화학회에서는 각각 시야 수 20과 22의 대안렌즈를 사용할 것을 권고하고 있다. 대안렌즈의 시야 수를 특정하는 것이 수기 요침사검사의 HPF를 표준화에 반드시 필요하다고 판단되므로 전국 단위로 요침사검사를 위해 가장 많이 이용 중인 대안렌즈의 시야 수를 확인하는 것이 좋을 것으로 생각된다.

본 연구결과에 따르면 변환계수를 이용하여 손쉽게 특정 시야 수의 대안렌즈에서 계수한 HPF당 세포 수로 변환할 수 있으므로 특정 시야 수의 대안렌즈를 사용하지 않고 있는 검사실에서 대안렌즈를 교체하지 않아도 적절한 보고가 가능할 것으로 생각되나, 요침사검사 담당 검사실 직원이 바뀌거나 다른 시야 수의 대안렌즈가 장착된 현미경으로 교체될 수 있으므로 이 변환법에 대한 지속적인 점검과 교육을 실시해야 한다. 이러한 잠재적인 문제를 없애고자 한다면 특정 시야 수를 가지는 대안렌즈만을 이용하여 수기 요침사검사를 시행하는 것이 적절할 것으로 보인다. 본 연구자는 시야 수 18과 22 대안렌즈를 별도로 구입하여 본 연구에 이용하였다. 캘리브레이션 자 슬라이드(microscopy calibration ruler slide)를 이용하여 원지름을 점검하였고 요침사검사를 수행하기 적절할 정도로 시야가 맑은지 확인한 후 본 연구에 활용하였다. 대안렌즈만을 별도로 구입이 가능하므로 몇 가지 점검 후 별 다른 문제가 없다면 현미경 교체 없이 대안렌즈로 바꿔 요침사검사를 수행할 수 있을 것으로 생각된다.

결론으로 HPF 면적비율을 이용한 변환법으로 기준 시야 수와 다른 시야 수를 가지는 대안렌즈를 이용한 경우 기준 시야 수 대안렌즈에서의 HPF당 세포 수를 표준화할 수 있었다. 요침사검사 가이드라인에 요침사검사를 위한 광학현미경의 대안렌즈 시야 수를 특정하는 것이 필요할 것으로 생각된다.

이 연구는 2021년도 대한진단검사정도관리협회 학술연구과제(2021-20)로 수행되었다.