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pISSN 2950-9114 eISSN 2950-9122
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Original Article

Lab Med Qual Assur 2024; 46(2): 87-95

Published online June 30, 2024

https://doi.org/10.15263/jlmqa.2024.46.2.87

Copyright © Korean Association of External Quality Assessment Service.

Effect of Whole Blood Fixatives on Cell Fraction and Immunophenotypic Marker Stability in Bone Marrow Specimens Examined by Flow Cytometric Analyses

Woo Yong Shin1 , Hae In Bang2 , Jung-Ah Kim2 , Jieun Kim2 , Rojin Park2 , Jeong Won Shin2 , and Tae Youn Choi2

1Department of Laboratory Medicine, CHA Gangnam Medical Center, CHA University School of Medicine; 2Department of Laboratory Medicine, Soonchunhyang University Seoul Hospital, Seoul, Korea

Correspondence to:Hae In Bang
Department of Laboratory Medicine, Soonchunhyang University Seoul Hospital, 59 Daesagwan-ro, Yongsan-gu, Seoul 04401, Korea
Tel +82-2-709-9430
E-mail genuine43@schmc.ac.kr

Received: November 23, 2023; Revised: March 12, 2024; Accepted: March 13, 2024

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Background: Since the clinical application of flow cytometry, many clinical laboratories have utilized this method for diagnosing hematologic malignancies. However, delays in testing can occur due to various reasons. To address this issue, whole blood fixatives are occasionally administered. Hence, this study aimed to determine the impact of applying whole blood fixative on bone marrow specimens.
Methods: Nine samples without lymphoma/leukemia bone marrow involvement were examined. Flow cytometry was performed using 17 common markers. The samples were stored at room temperature (RT) and 4°C without fixative treatment, stored at 4°C after TransFix (Cytomark, UK) treatment, and stored at RT after Cyto-Chex (Streck, USA) treatment. Subsequently, the samples were divided into groups and examined. A total of 13 tests were conducted on each sample for up to 5 days.
Results: The neutrophil and monocyte fractions improved when the samples were stored at 4°C, while no significant difference was observed in the lymphocyte fractions. The fluorescence intensity of the markers varied depending on the marker and conditions, with the most stable markers observed when stored in TransFix at 4°C, followed by storage at 4°C, CytoChex RT, and RT.
Conclusions: The use of fixative on bone marrow specimens maintained the stability of markers during delayed testing. Both fixatives are more effective in preserving marker intensity and cell fractions compared with RT storage. Refrigeration and the use of fixatives may be beneficial for examinations delayed beyond 72 hours.

Keywords: Flow cytometry, Fixatives, Preservative, Bone marrow, Stability

유세포 분석은 1980년대 임상에 적용되기 시작하면서 현재에 이르기까지 시약의 개발과 표준화에 있어 많은 발전을 해오고 있다. 사용 가능한 레이저의 종류가 증가되고 이에 따라 한번에 분석 가능한 파라미터도 증가하여 대부분의 임상검사실에서 유세포 분석은 혈액종양 환자의 진단에 많이 활용되고 있다[1]. 그러나 유세포 분석은 고가의 장비와 숙련된 전문가가 필요하기 때문에 외부 의뢰를 시행하는 경우가 많으며, 이러한 경우 검사실에 검체가 도착할 때까지 걸리는 시간이 길어지게 된다. 이 외에도 장비나 인력 운용의 문제와 휴일 전일 늦게 접수되는 경우 등 바로 검사를 진행하지 못하는 경우가 생길 수 있다. 검체 보관기간이 길어지면 점진적인 세포 사멸이 이루어지는데, 이로 인해 항원 재배치를 통한 세포 표현형의 변화, 세포 부스러기의 증가 및 비특이적 항체결합 등의 문제가 생기게 된다[2-4]. 이에 일부 검사실에서는 골수 검체에 전혈 고정액을 사용하고 있으나 그 효과에 대해서는 연구가 미비한 실정이다. 골수 검체는 말초혈액 검체와는 다르게 지방이 많고 채취 시 압력이 많이 들어가기 때문에 세포가 손상되어 있는 경우도 많다. 본 연구에서는 말초혈액과는 다른 검체 조건을 가지고 있는 골수 검체에서의 전혈 고정액의 영향에 대한 정보를 제시하고자 한다.

1. 검체

만성백혈병/림프종 의심하 골수검사가 의뢰된 환자의 골수 검체 중 골수 침범이 확인된 종양세포군은 제외하고 림프종의 골수 침범이 없는 것으로 판독된 검체 9건을 대상으로 하였다. 분석에 사용하는 전혈 고정액으로는 국내•외 가장 많이 사용되고 있는 TransFix (Cytomark, Buckingham, UK)와 Cyto-Chex (Streck, La Vista, NE, USA) 두 가지 종류를 사용하였다.

보관조건은 고정액을 처리하지 않은 검체는 실온과 4℃ 냉장보관 둘 다, 고정액을 처리한 후 보관조건은 제조사에서 추천하는 방법에 따라 TransFix 처리 검체는 4℃, Cyto-Chex 처리 검체는 실온보관하여 비교하였다. 고정액 처리 없이 실온 보관 검체를 그룹1로, 고정액 처리 없이 4℃에 보관한 검체를 그룹2로, TransFix 처리 후 4℃에 보관한 검체를 그룹3으로, Cyto-Chex 처리 후 실온보관한 검체를 그룹4로 나누어 검사하였다. 검체 채취 후 검사가 5일을 넘어가는 경우는 거의 없으므로 각 그룹별로 검체 도착 즉시, 24시간 후, 72시간 후, 5일 후 동일 검사를 시행하였다. 5일째 검사는 검사일이 휴일인 경우 ±1일 차이는 허용하였다. 즉시 검사한 결과를 기준으로 삼고 분석하였다. 이 중 그룹1 외의 검체는 도착 즉시에는 검사하지 않고 24시간 이후부터 검사하였다. 따라서 한 검체당 총 13회 검사하였다. 본 연구는 순천향대학교 서울병원 임상연구심의위원회(institutional review board, IRB)의 승인을 받았다(IRB file no., 2022-03-004).

2. 검사 패널

일반적으로 골수의 분율 계수가 이루어지는 중성구, 단구, 전체 림프구에 더해 림프종 침범 확인을 위해 세분화된 T림프구, B림프구, natural killer (NK) 세포를 검출 가능한 만성림프구성 백혈병 및 림프종 패널 6 color-7 tube법(17개 표지자)을 Navios EX Flow Cytometer 및 Kaluza Analysis (Beckman Coulter, Miami, FL, USA)를 사용하여 분석하였다(Table 1). 분석할 때는 각 튜브당 10만 개의 세포를 수집하였다. 세포 분율 변화는 CD45와 SSC (side scatter) 도표에서 중성구, 단구, 전체 림프구 분율을 확인하고 CD3와 CD19 도표에서 T림프구 및 B림프구의 분율을, CD56 도표에서 NK 세포의 분율을 관찰했다. SYTO-16 형광손실은 조기 세포자살(early apoptotic event)의 민감한 표지자이다. 이 표지자를 통하여 시간의 경과에 따른 세포 생존율도 분석하였다.

Table 1 . Six-color 7-tube chronic lymphocytic leukemia and lymphoma panel.

FITCPEPC5PC7APC-750OC515
Surface stain
Tube 1IgG1IgG1IgG1IgG1CD19CD45
Tube 2CD4CD8CD3CD7CD19CD45
Tube 3KappaLambdaCD19CD45
Tube 4SYTO-16CD10CD5CD56CD19CD45
Cytoplasmic stain
Tube 5IgG1IgG1IgG1CD19CD45
Tube 6cMPOcCD79aCD19CD45
Tube 7TdTcCD22cCD3CD19CD45

Abrreviations: FITC, fluorescein isothiocyanate; PE, phycoerythrin; PC5, phycoerythrin cyanin 5; PC7, phycoerythrin cyanin 7; APC-750, allophycocyanin-Alexa Fluor 750; OC515, Orange Cytognos 515; IgG, immunoglobulin G..



형광강도 변화는 CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD45, CD56, kappa, lambda, cMPO, cCD79a, TdT, cCD3, cCD22 표지자의 변화를 확인하였다. 이 중 CD3, CD5, CD4, CD7, CD8, cCD3는 T림프구의 형광강도를 측정하였고, CD10, CD19, kappa, lambda, cCD79a, TdT, cCD22는 B림프구의 형광강도를, CD56은 NK 세포의 형광강도, cMPO 및 CD45는 중성구의 형광강도를 측정하였다.

3. 통계분석

수집한 데이터를 IBM SPSS Statistics ver. 27.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)로 일반화추정방정식을 통해 비교하였으며 P값이 0.05 미만인 경우 통계학적으로 유의한 것으로 판단하였다. MedCalc for Windows ver. 20.121 (MedCalc Software, Ostend, Belgium)을 사용하여 평균(95% confidence interval [CI] 범위)을 도식화하였다.

1. 분율 변화

즉시 검사와 비교하였을 때, 중성구의 분율은 실온이나 냉장보관 시 유의한 차이가 없었고 TransFix 냉장보관 시 72시간 뒤부터 유의하게 감소하여(P=0.013) 5일 뒤 11.83% (95% CI, 6.03–17.63)의 분율 감소를 보였고, Cyto-Chex 실온보관 시 5일 뒤 유의하게 감소하여(P=0.009) 8.72% (95% CI, 2.21–15.23)의 분율 감소를 보였다. 단구 분율은 냉장보관 시 유의한 차이가 없었고 실온보관 시 72시간 뒤부터 유의하게 감소하여(P=0.003) 5일 뒤 2.88% (95% CI, 1.58–4.17)의 감소를 보였다. TransFix 냉장보관 시 분율이 증가하는 경향을 보였으며 5일 뒤 2.95% (95% CI, 0.16–5.73) 증가로 유의한 차이가 있었고(P=0.038) Cyto-Chex 실온보관 시 24, 72시간 때에 유의하게 감소하기 시작하여 5일 뒤 0.59% (95% CI, −0.78 to 1.96)의 감소를 보였다(P=0.006). 전체 림프구는 모두 유의한 차이를 보이지는 않았으나 실온보관인 경우 다른 그룹에 비해 낮은 평균을 보였다. T림프구, B림프구는 모두 유의한 차이를 확인할 수 없었다. NK 세포는 실온보관 72시간 후 유의하게 감소하여(P=0.013) 5일 뒤 1.51% (95% CI, 0.51–2.51) 감소하였으며 그 이외의 그룹은 유의한 차이를 보이지 않았다. SYTO-16 양성세포는 실온에서 유의한 차이가 없었으며 냉장보관, TransFix 및 Cytochex 고정액 처리 5일 뒤 유의하게 감소하여 각각 2.97 (95% CI, 0.86–5.07; P=0.006), 2.46 (95% CI, 0.33–4.60; P=0.023), 7.46 (95% CI, 2.89–12.03; P=0.001)의 분율 감소를 보였다(Fig. 1).

Figure 1. Changes in each cell fraction at various time points. Group 1: samples stored at room temperature without fixative treatment; Group 2: stored at 4°C without fixative treatment; Group 3: stored at 4°C after TransFix treatment; Group 4: stored at room temperature after Cyto-Chex treatment. (A) Neutrophil (%). (B) Monocyte (%). (C) Lymphocyte (%). (D) B lymphocyte (%). (E) T lymphocyte (%). (F) Natural killer (NK) cell (%). (G) SYTO-16 (%). *P<0.05.

2. 표지자의 형광강도 변화

1) 실온보관 그룹

즉시 검사와 비교했을 때, 실온보관한 경우 CD3, CD4 및 CD5의 형광강도는 72시간 후부터 유의하게 감소했다(P=0.000, 0.007, 0.000). CD7 또한 72시간 후부터 유의하게 감소하였으며(P=0.000) CD8은 24시간 후부터 형광강도가 유의하게 감소하기 시작하여(P=0.001) 쭉 감소하는 경향을 보였다.

CD10은 시간에 따른 유의한 변화를 보이지 않았고 CD19, kappa 및 lambda는 72시간 후부터 유의하게 감소하였다(P=0.006, 0.001, 0.000). CD45는 24시간 후부터 감소하기 시작했고(P=0.002), CD56은 시간 및 그룹에 따라 유의한 차이가 없었다.

cMPO는 24시간 후부터 형광강도가 증가하기 시작하여(P=0.023) 5일 후까지 증가하였다. cCD79a는 24시간 후부터 형광강도가 유의하게 감소하였다(P=0.000). TdT, cCD3은 5일 후까지 유의한 차이를 보이지 않았다. cCD22는 5일 후부터 유의하게 감소된 형광강도를 보였다(P=0.005).

2) 냉장보관 그룹

냉장보관 시 즉시 검사와 비교했을 때 CD3, CD4, CD5 및 CD8은 24시간 후부터 형광강도가 유의하게 감소하기 시작했다(P=0.001, 0.036, 0.018, 0.009). CD7 및 CD45는 72시간 후부터 형광강도가 유의하게 감소되었다(P=0.002, 0.001). CD10 및 CD19는 5일 후까지 유의한 차이가 없었으며 kappa는 72시간 시점에서 잠시 유의하게 낮게 측정되었으나(P=0.044) 5일 후에는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다. Lambda는 5일 후에 유의한 감소를 보였다(P=0.016). CD56은 5일 후까지 유의한 차이 없이 형광강도가 유지되었다. cMPO는 72시간 경과 후부터 유의한 형광강도 증가를 보였다(P=0.002). cCD79a, TdT, cCD3, cCD22는 모두 5일 후까지 유의한 차이를 보이지 않았다.

3) TransFix 냉장보관 그룹

TransFix 처리 후 냉장보관한 그룹은 CD3, CD5 및 CD10에서는 즉시 검사와 유의한 형광강도 차이를 보이지 않았다. CD4, CD7, CD8 및 CD19는 24시간 후부터 유의하게 형광강도가 감소하였다(P=0.007, 0.015, 0.000). Kappa, lambda, CD45 및 CD56은 5일 후까지 유의한 차이 없이 형광강도가 보존되었다.

cMPO는 24시간 후부터 유의하게 강도가 증가하였다(P=0.000). cCD79a는 24시간 후부터 유의한 감소를 보였으며(P=0.000) TdT는 5일 후까지 유의한 차이를 보이지 않았다. cCD3 및 cCD22는 72시간 경과 시에 유의하게 감소했으나(P=0.001, 0.049) 5일 경과 후에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다(P=0.089, 0.230).

4) Cyto-Chex 실온보관 그룹

즉시 검사와 비교했을 때 Cyto-Chex 실온보관 그룹은 24시간 후부터 CD3, CD4, CD7, CD8, CD19의 형광강도가 유의하게 감소하였다(P=0.000, 0.000, 0.001, 0.000, 0.000). CD5의 형광강도는 72시간까지 유의한 차이 없이 유지되다가 5일 후 유의하게 감소하였다(P=0.003). CD10 및 kappa의 형광강도는 5일 후까지 유의한 차이 없이 유지되었으나, lambda의 형광강도는 72시간 후부터 유의하게 감소하였다(P=0.016). CD45는 24시간 후부터 유의한 형광강도 감소를 보였다(P=0.010). CD56은 5일 후까지 유의한 차이가 없었다.

cMPO의 형광강도는 24시간 후부터 유의하게 증가하였다(P=0.009). cCD79a의 형광강도는 24시간 후부터 유의하게 감소했다(P=0.000). TdT, cCD3는 5일 동안 유의한 차이 없이 형광강도가 유지되었으며 cCD22는 5일 후 검사에서만 유의한 차이를 보였다(P=0.001).

5일 후까지 보존방법과 관계없이 형광강도가 유지된 표지자는 CD10, CD56, TdT였다. 반대로 72시간 이내에 보존방법과 관계없이 유의한 차이가 관찰된 표지자는 CD4, CD7, CD8, cMPO였다(Table 2, Fig. 2).

Table 2 . Markers preserved at various time points for each storage method.

MarkersStorage method
RT4℃TransFix, 4℃Cyto-Chex, RT
CD3CDAD
CD4CDDD
CD5CDAB
CD7DCDD
CD8DDDD
CD10AAAA
CD19CADD
CD45DCAD
CD56AAAA
KappaCA*AA
LambdaCBAC
cMPODCDD
cCD79aDADD
TdTAAAA
cCD3AAA*A
cCD22BAA*B

A: not significant; B: significant difference after 5 days; C: significant difference after 72 hours; D: significant difference after 24 hours..

Abbreviation: RT, room temperature..

*No significant difference observed excluding 72 hours..


Figure 2. Fluorescence intensity changes observed in each marker at various time points. Group 1: samples stored at room temperature without fixative treatment; Group 2: stored at 4°C without fixative treatment; Group 3: stored at 4°C after TransFix treatment; Group 4: stored at room temperature after Cyto-Chex treatment. (A) CD4 (MFI). (B) CD8 (MFI). (C) CD3 (MFI). (D) CD7 (MFI). (E) CD19 (MFI). (F) Kappa (MFI). (G) Lambda (MFI). (H) CD10 (MFI). (I) CD5 (MFI). (J) CD56 (MFI). (K) cMPO (MFI). (L) cCD79a (MFI). (M) TdT (MFI). (N) cCD22 (MFI). (O) cCD3 (MFI). (P) CD45 (MFI). Abbreviation: MFI, mean fluorescence intensity. *P<0.05.

유세포 분석은 현재 혈액종양의 진단에 널리 사용되고 있다. 그러나 시간이 지날수록 세포는 파괴되고 표면 항원을 잃어버리며 비특이적인 결합이 증가하여 즉시 검사를 진행할 수 없는 환경에서는 사용하기 어렵다는 한계가 있다[5]. 검사가 지연되는 경우 검체를 안정화하기 위해 전혈 고정액이 사용되는데, 현재 널리 쓰이고 있는 전혈 고정액은 TransFix 및 Cyto-Chex이다. 전혈 고정액 사용은 림프구의 생물학적 일관성은 72시간 이후에도 유지시킬 수 있는 것으로 보이나, 과립구나 단구에서는 림프구보다 낮은 보존효과를 보인다[5]. 백혈병 표현(leukemic manifestation)이 흔한 림프종도 있으나, 림프구 침윤 및 응집(lymphocytic infiltration/aggregation) 형태로 골수에 침범하는 림프종도 다수 존재한다. 이러한 림프종의 병기결정을 위하여 골수 검체 검사가 필요한데, 현재까지 이루어진 세포 고정액의 연구는 말초혈액 및 cerebrospinal fluid에 대한 것이 대부분이다[6-8]. 국내 Yoon 등[9]은 발작성야간혈색소뇨증 유세포 검사에서 전혈 고정액의 효과를 보고자 하였으며 검체는 말초혈액이었다. 세포 고정액으로 Ficoll PM70 용액, Cyto-Chex, TransFix를 사용하였으며, 연구결과, 검체를 냉장보관하는 것에 비하여 개선효과가 있지는 않았다고 보고하였다. 국외 Diks 등[2]도 역시 말초혈액을 사용하여 PIDOT (primary immunodeficiency orientation tube)를 분석하였으며 세포 분포는 개선하였지만 표지자의 표현에는 좋지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서는 말초혈액에 국한되지 않은, 골수 검체에서의 세포 분포와 표지자 형광강도에 대한 정보를 제시한다.

대부분의 혈구세포는 그룹과 관계없이 72시간 경과 후 유의하게 분율이 감소했다. SYTO-16으로 확인한 세포 생존율은 시간에 따라 감소하였고 보관 5일 뒤 즉시 검사에 비하여 유의하게 감소하였지만 감소한 생존율은 각 그룹 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다.

표지자의 형광세기는 T세포의 경우, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, cCD3을 보았고 cCD3을 제외하고 감소하는 경향을 보였다. 표지자마다 조금씩 다른 양상을 보여주기는 하였으나 실온보관의 경우 대부분 72시간, 즉 3일 후부터 유의하게 감소하는 모습을 보여주었고 냉장을 하거나 고정액을 처리하는 경우 24시간 검사에서부터 유의하게 감소하는 모습을 보여주었다. 예외로, CD3과 CD5의 경우 TransFix 냉장보관 시 다른 보관법과는 다르게 시간에 따른 유의한 차이를 보이지 않았다.

B세포의 경우, CD10, CD19, kappa, lambda, cCD79a, cCD22를 보았고 대부분 감소하는 경향을 보였다. CD19, cCD79a의 경우 냉장보관하는 경우 시간에 따라 유의한 차이를 보이지 않아서 B림프구 분석에는 냉장보관이 가장 좋을 것으로 판단된다. 다만, kappa, lambda가 고정액 사용에 따라 형광강도에는 유의한 변화가 없는 것으로 나타났으나, 비특이적인 결합이 증가하여 이중 양성(double-positive) B림프구의 분율이 증가하여 kappa, lambda 세포의 분율에는 이를 적용하기 어려웠다. 중성구, 단구 및 NK 세포 측정에는 무리가 없으나 만성 림프구성 백혈병 혹은 림프종의 골수 침범이 의심되는 경우, 고정액의 사용을 통해 B림프구 경쇄 제한을 확인할 때는 유의해야 하겠다. 또한 악성세포의 침범이 없는 골수를 대상으로 한 연구로 이러한 분율 및 형광세기의 변화가 실제 검출률에 어떠한 변화를 주는지 검체 보관조건의 적합성 판단에 있어서 한계가 있었다. 추가로 악성림프종 등에서 종양세포가 적은 수로 존재하는 경우 이를 보존, 검출할 수 있을지에 대한 추가 연구가 필요하겠다.

본 연구에서는 골수 검체 채취 후 5일까지의 안정성을 확인하여 빠른 검사가 여의치 않을 경우 고려할 수 있는 보관방법 및 세포 분율 및 표지자 형광강도의 변화 추이를 제시하였다. 시간이 흐를수록 세포의 분율 감소 및 cMPO를 제외한 대부분의 표지자에서 형광세기가 감소하는 경향을 보이긴 하였으나 양성과 음성을 구분하기에 큰 어려움은 없어 냉장 및 두 가지 전혈 고정액 모두 어느 정도 표지자를 안정화시키는 것으로 기대할 수 있었다. cMPO의 형광강도 상승은 중성구를 사용해서 분석했는데, 중성구는 전혈 고정액의 효과가 미미하며 시간이 지날수록 표면 투과성이 증가하는 것으로 알려진 것과 관계가 있는 것으로 보인다[5]. 세포 분율 및 형광세기에 있어서 24시간까지는 오히려 실온보관이 가장 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 72시간 이후로는 시간이 지날수록 자가형광이 증가함이 보고되어 있고[10], 본 연구에서도 유의한 차이를 보이는 표지자가 다수 존재하여 냉장이나 전혈 고정액의 사용이 유용할 것으로 생각된다. 고정액의 사용에서 TransFix의 경우, CD3, CD5, kappa, lambda 표지자의 형광세기를 잘 유지한다는 점에서 장점이 있었으나 TransFix는 고온에서 자가형광의 증가를 보이는 보고가 있어 온도에 주의해야 할 것이다[11]. Cyto-Chex는 대부분 낮은 형광강도를 보였는데, CD3, CD19와 같은 일부 표지자들은 Cyto-Chex 처리 후 수시간 안에 유의하게 감소한다는 보고가 있고[6,12] 본 연구에서도 CD3 및 CD19와 같이 림프구를 확인하기 위해 중요한 표지자들이 24시간 이후부터 유의하게 감소한 차이를 보여 일부 표지자의 부분적 손실을 보이는 것으로 생각된다. MFI의 보존이 중요한 표지자를 평가할 때는 TransFix가 Cyto-Chex보다 유용할 것으로 생각되나, 고정액 처리 없이 실온보관한 검체와 비교하면 Cyto-Chex 역시 이점이 있을 것으로 판단된다. 냉장보관 시 모든 검사 시점에서 세포의 분율에서 유의한 차이를 보이지 않았기 때문에 검체 채취 후 분석 시까지 24시간이 경과할 것으로 판단되면 세포의 보존을 위해 냉장보관을 하는 것이 분석에 도움이 될 것으로 생각되었다. 다만, 형광의 세기는 변화한다는 점은 유의해야 하겠다.

이 논문은 대한임상검사정도관리협회의 2022년 학술연구비 지원을 받아 시행한 결과를 바탕으로 작성되었다(과제번호: 2022-013).

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